[发明专利]一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体、慢病毒载体及应用

说明书

本发明公开了一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括前导肽、ScFv、铰链区及跨膜区、免疫受体酪氨酸活化基序、IRES和tCD20。还公开了一种慢病毒表达载体，其包含有编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列。还公开了可以表达该嵌合抗原受体的免疫细胞。将本发明的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可有效杀伤抗原阳性的肿瘤细胞且对阴性细胞无毒副作用，携带的tCD20既可以做检测CAR表达的标签肽，又可以在杀伤肿瘤细胞后加入清除性抗体，如利妥昔单抗，从而清除CAR‑T细胞，保障临床上使用的安全性。

技术领域

本发明涉及一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体、慢病毒载体及应用，属于基因工程领域中的肿瘤免疫治疗技术。

背景技术

据WHO统计，癌症成为威胁人类健康的第二大杀手。有数据显示，全球每年新发病例将达到1406.8万，每年因癌症死亡的病例将达到820.1万。在继手术、化疗和放疗等技术都无法取得良好的治疗效果的情况下，人们把目光逐渐聚焦到生物治疗领域。

细胞治疗是生物治疗领域的重要分支，嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptors，CAR)T细胞被认为是目前细胞治疗领域的明日之星，因其在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤治疗上的显著疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

CARs的一大优势是由于它是靶向细胞表面的分子，因此可以不受T细胞受体(Tcell receptor，TCR)识别主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)的限制从而避免肿瘤细胞通过抗原赠予或表达白细胞抗原产生逃逸。基因修饰的T细胞不仅仅是给T细胞上授予一个新的抗原反应，而且可以通过插入基因来增强T细胞的效应。为了克服因TCR识别能力缺乏而导致的肿瘤免疫耐受，T细胞中通过基因修饰的CAR包含编码抗体基本识别区的序列。单链抗体(single chain Fv，ScFv)是由1条单肽链按VL-linker-VH的顺序所组成，大小仅为完整抗体的1/6，是抗体与抗原结合的最小单位。CARs的胞外区就由特异的ScFv组成。

1989年，Gideon Gross等人通过基因工程的方法改造T细胞受体(T-cellreceptor,TcR)基因，用抗体的可变区(V区)对TcR的胞外区进行替换，并成功靶向目标细胞，首次提出CAR的概念并预言此项技术可以在临床应用。时至今日，CAR的研究已经如火如荼，其设计思路大致分为四代；第一代CARs编码抗体为基础的外置受体结构和编码由酪氨酸触发的主要免疫受体如TCRζ和FcRγ等信号传导分子的胞内结构；第二代CARs还包括一个共刺激信号区如CD28或4-1BB；第三代CARs的胞内区则包括两个或两个以上，包括CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40。而第四代CAR也被称作TRUCKs(卡车)或“装甲”CARs，其结合了第二代CAR-T和高表达抗肿瘤活性的因素，比如细胞因子、共刺激配体或可降解实体瘤胞外基质的酶。

CAR-T细胞中CAR阳性表达率不能直接通过抗体进行检测，需要使用通用抗体或自带标签进行间接测定。通用抗体如IgG的某一片段加上二抗来进行间接标记，这样做的优点是载体上不需要引入其他DNA序列；缺点是容易出现非特异性结合，所以背景较高，另外不是所有CAR都可以用通用抗体进行标记，所以需要购买抗体进行试验，浪费资金和时间。自带标签如His，Myc等虽然容易构建和检测，但是它们属于异源性蛋白，容易引发排斥反应，增加临床使用风险。CD20是在B淋巴细胞表面表达的激活的糖基化磷酸蛋白，蛋白大小为33-35kD，为跨膜4A基因家族(MS4A)的成员之一，有43个氨基酸位于细胞膜外。本发明将截短的人CD20抗原(Truncated CD20，tCD20)肽段插入CAR载体，首要目的是作为自带标签检测CAR的表达情况。tCD20既能够直接用CD20抗体进行检测来标记CAR的表达率，又属于人的蛋白，临床应用时不会因标签本身产生排斥。