[发明专利]一种LytR功能缺陷的肺炎链球菌、疫苗及其制备方法及应用

权利要求书

1.一种LytR功能缺陷的肺炎链球菌的制备方法，其特征在于：包括以下几个步骤，

步骤一：材料：包括肺炎链球菌D39野生菌株、细菌DNA提取试剂盒、PCR用Prime Star高保真酶、dNTPs、Buffer、MgCl₂；

步骤二：引物的设计合成，以肺炎链球菌D39野生菌株的基因组DNA为模板，参照其全序列，使用primer premier5设计引物；

步骤三：步骤二中的引物包括三种，分别为up片段扩增所用引物、down片段扩增所用引物和erm片段扩增引物；

up片段扩增所用引物设计：

P1：正5’-AAAGTCCCACCTATACTATCGTGAG-3’；

P2：反5’-ATCAAACAAATTTTGGGCCCGGTTCTACTAACCTATCAGTTTACCCAT-3’；

down片段扩增所用引物设计：

P3：正5’-ATTCTATGAGTCGCTGCCGACTAATAAAAAAATCAATCGTAGGAAAAA-3’；

P4：反5’-ATAGCAAAAGTCTCGTAAAGAAATT-3’；

erm片段扩增引物设计：

P5：正5’-CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT-3’；

P6：反5’-AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT-3’；

up片段所用扩增液内的各物质的体积为：ddH₂O=31.5μL，5×buffer=10μL，dNTP=4μL，P1=1μL，P2=1μL，DNA模板=2μL，prime star高保真酶=0.5μL；

该扩增条件为：首先在98℃下扩增10s，随后在50℃下扩增15s，接着在72℃下扩增90s，在该扩增条件下循环扩增30次后，再在72ºC下扩增10min后完成up片段扩增；

down片段所用扩增液内的各物质的体积为：ddH₂O=31.5μL，5×buffer=10μL，dNTP=4μL，P3=1μL，P4=1μL，DNA模板=2μL，Prime Star高保真酶=0.5μL；

该扩增条件为：首先在98℃下扩增10s，随后在63℃下扩增15s，接着在72℃下扩增50s，在该扩增条件下循环扩增32次后，再在72℃下扩增5min后完成down片段扩增；

erm片段所用扩增液内的各物质的体积为：ddH₂O=31.5μL，5×buffer=10μL，dNTP=4μL，P5=1μL，P6=1μL，DNA模板=2μL，prime star高保真酶=0.5μL；

该扩增条件为：首先在98℃下扩增10s，随后在55ºC下扩增15s，接着在72℃下扩增60s，在该扩增条件下循环扩增30次后，再在72℃下扩增10min后完成erm片段扩增；

步骤四：将步骤三中的up片段、down片段和erm片段，分别采用罗氏PCR产物纯化试剂盒进行纯化；

步骤五：针对步骤四中的up片段、down片段和erm片段，进行SPD_1741up–erm–SPD_1741down连接片段PCR扩增；其各物质的摩尔比为：引物：DNA模板=1：40，up片段：erm片段：down片段=1：1：1；而该扩增的各物质的体积为：ddH₂O=30.5μL，5×buffer=10μL，dNTP=4μL，P1=1μL，P4=1μL，up=1μL，down=1μL，erm=1μL，prime star高保真酶=0.5μL；

扩增的条件：首先在98ºC下扩增10s，随后在58℃下扩增15s，接着在72℃下扩增3min，在该扩增条件下循环扩增33次后，再在72℃下扩增10min后完成扩增，得到SPD_1741up–erm–SPD_1741down；

步骤六：步骤五中所述的SPD_1741up–erm–SPD_1741down连接PCR片段，经扩增后，得到编码产物，随后使用胶回收试剂盒对编码产物回收；

步骤七：将肺炎链球菌D39野生菌株培养于含1×BSA+CaCl₂的C+Y培养基中，在C+Y培养基中添加葡萄糖、小分子抑制剂或单克隆抗体，其中添加的葡萄糖浓度大于等于0.15%，当菌株密度达到A₆₀₀=0.1时，在90μL的C+Y培养基加入10μL的感受态刺激因子，并于37℃水浴箱内孵育10min后，加入10μL的SPD_1741up–erm–SPD_1741down连接PCR片段胶回收产物，并将产物置于冰块上30min；再于37℃水浴箱孵育90min，然后铺于含有0.25mg/L的红霉素的TSA血平板上，于37℃的孵箱内培养24～48h，而成功整合了erm片段的肺炎链球菌会在含有红霉素的TSA血平板上生长，形成菌落；

步骤八：挑取步骤七中的单个菌落，放置于C+Y培养基中培养，当菌落的菌密度达到A₆₀₀=0.5时，冻于箱内温度为-80℃的冰箱保存，即得到疑似SPD_1741基因被红霉素基因替代的肺炎链球菌D39缺陷菌株；

步骤九：将步骤八中得到的肺炎链球菌D39缺陷菌培养于C+Y培养基中，当缺陷菌的密度A₆₀₀=0.5，用DNA提取试剂盒提取其DNA，并以SPD_1741设计的引物、P5和P6为引物在PCR仪内扩增SPD_1741基因片段和erm片段，用胶回收试剂盒进行回收，进行基因测序，测序结果证实目的基因正确转化入肺炎链球菌D39，无碱基突变，得到肺炎链球菌D39ΔSPD_1741。