[发明专利]分子伴侣辅助表达寨卡病毒E蛋白的重组多形汉逊酵母及其构建方法

说明书

本发明提供了一种分子伴侣辅助表达寨卡病毒E蛋白的重组多形汉逊酵母及其构建方法。首先构建重组寨卡病毒结构蛋白E与分子伴侣多形汉逊酵母钙连结蛋白的共表达载体，其中，重组寨卡病毒结构蛋白E序列如SEQ.ID.NO.1所示，多形汉逊酵母钙连结蛋白基因片段如SEQ.ID.NO.2所示；其次，将线性化的共表达载体通过电穿孔转化法转化到多形汉逊酵母细胞，经诱导培养，重组多形汉逊酵母发酵产物经纯化后，检测到重组蛋白含量可达12.6mg/L。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种寨卡病毒糖蛋白基因的多形汉逊酵母表达系统的建立。

背景技术

寨卡病毒(Zika virus)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，与登革病毒、黄热病毒、乙脑病毒、西尼罗病毒特征相似，寨卡病毒为单股正链RNA病毒，近年来感染率有所升高，寨卡病毒的流行不但严重威胁人民群众的生命安全，而且造成了严重的心理影响和沉重的经济负担。

寨卡病毒基因组长约10.8kb，含一条单一开放读码框，病毒蛋白由一个单一的多蛋白前体，经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切而成，病毒蛋白包括3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。和其他黄病毒属病毒类似，寨卡病毒的结构蛋白E(Zika virus structure protein E，ZKE)高度保守且含有多个中和抗原决定簇。此外，ZKE是与细胞膜受体相结合并与细胞膜融合而使病毒进入细胞的主要蛋白，与病毒的吸附、穿入、致病性、组织嗜性和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。因此，寨卡病毒结构蛋白E是引起宿主机体免疫及产生中和抗体的主要抗原蛋白，能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击。

多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha，H.polymorpha)属于甲醇型酵母，其作为单细胞低等真核生物，不仅具有易培养、繁殖快、便于遗传操作、能对外源产物进行翻译后加工和修饰及无毒性代谢产物等优点，还具有其特有的耐高温特性。这些优点使多形汉逊酵母表达系统近年来迅速发展成为生物工程领域中备受关注的主要细胞工厂之一。多形汉逊酵母表达系统已经成功用于表达许多药用、工业用蛋白质及酶制剂，如具有诊断和治疗价值的真核生物蛋白，其中一些已得到商业化推广，如水蛭素、乙型肝炎病毒表面抗原B(HBsAg)、人干扰素(IFNa-2a)、胰岛素、青霉素、明胶、尿酸氧化酶、植酸酶。

目前，国内外尚未见到利用多形汉逊酵母宿主表达寨卡病毒结构蛋白E的报道。主要的难点可能在于：蛋白质的分泌表达取决于蛋白质N端一段额外序列和蛋白质能否实现正确折叠，然而受到ZKE蛋白结构和折叠的影响，宿主细胞的ZKE蛋白外源表达效率较低甚至不表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子伴侣辅助表达寨卡病毒E蛋白的重组多形汉逊酵母及其构建方法，为进一步研制寨卡疫苗基因工程菌奠定基础。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明首先提供一种寨卡病毒结构蛋白E的分泌型高通量表达载体，该表达载体表达的目的基因为如SEQ.ID.NO.1所示的重组寨卡病毒结构蛋白E序列或与其(SEQ.ID.NO.1)同源性达90％以上的序列，所述表达载体还共表达目的基因表达产物的分子伴侣序列。

所述表达载体包括两个表达框，其中一个表达框为重组寨卡病毒结构蛋白E基因表达框，另一个表达框为分子伴侣表达框，重组寨卡病毒结构蛋白E基因表达框包括第一真核启动子(例如MOX启动子)、与所述目的基因共表达的分泌信号肽序列(例如α伴侣因子)以及所述目的基因，分子伴侣表达框包括第二真核启动子(例如FMD启动子)以及钙连结蛋白(例如多形汉逊酵母钙连结蛋白)开放读码框。

上述重组寨卡病毒结构蛋白E序列的设计来源于寨卡病毒结构蛋白E基因，设计的要点在于：1)去除了寨卡病毒结构蛋白E基因自身的分泌信号肽序列部分，2)同时去除了部分疏水区的编码序列。