[发明专利]一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种高迁移率蛋白HMGB3在监测肝细胞恶性转化过程的应用，包括以下步骤：动物分组，模型制备，制作大鼠肝脏组织的石蜡切片，大鼠肝脏的HE染色，Trizol法检测并计算大鼠肝癌形成动态过程中HMGB家族的mRNA表达水平，和免疫组化技术检测大鼠肝癌形成过程中HMGB3的蛋白表达水平。本发明构建了大鼠肝癌模型，以2‑乙酰氨基芴诱发肝细胞恶性转化，通过RT‑qPCR发现，分析肝癌形成的不同阶段HMGB家族成员mRNA水平，发现HMGB3表达在肝恶性转化过程中呈动态增长；并且免疫组化验证HMGB3蛋白水平在肝癌形成的过程中表达显著增高；由此可见HMGB3可以用于肝细胞恶性转化过程的动态监检。

技术领域

本发明涉及医学研究开发利用技术领域，具体涉及一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法。

背景技术

肝细胞性肝癌(HCC)是全世界最普遍的恶性肿瘤之一，HCC的发生发展是多病因、多基因、多步骤及多因子协同的复杂过程，涉及到癌基因激活，抑癌基因失活及胚胎期某些癌基因重新复活等多信号通路和基因调控。目前肝癌的血清学诊断标志物主要为AFP，但其效果并不理想，直接影响其临床治疗。所以，寻找特异有效的早期标志物，对于HCC的诊治具有十分重要的意义。

高迁移率蛋白家族(HMGB)具有四个成员，分别为HMGB1, HMGB2, HMGB3，和HMGB4。他们具有相似的生理和病理特点。HMGB基因可编码一个或多个DNA绑定结合域。HMGB家族参与多种胞内生理过程，包括细胞分化，迁移，并与多种炎症反应相关。 HMGB3是一种多功能蛋白，主要定位于细胞核，染色体和细胞质中。HMGB3参与多种生理病理过程，其可以促进造血干细胞的自我更新和分化，能强化DNA 弹性以促进某些启动子的激活。近年，在胃癌，肺癌，食管癌，乳腺癌，结直肠癌和膀胱癌中发现HMGB3可促进肿瘤细胞增殖转移。但是目前，HMGB3与HCC的关系尚未明确。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，动态检测大鼠模型中肝细胞恶性转化的过程。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，包括以下步骤：

（1）动物分组：选取40只的斯普拉格-杜勒鼠，饲养于12h昼夜循环，且湿度为55%的洁净空间内；随机选取10只大鼠作为健康对照组，其余分配为5组化学诱癌组。

（2）模型制备：健康对照组的大鼠进行普通喂食；化学诱癌组的大鼠予以添加有0.05% 的2-乙酰氨基芴的普通饲料进行喂养；每两周取一只正常鼠和一组诱癌鼠，在诱癌过程中根据病理组织学检测，分为健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组；摘取健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠的鼠肝组织，均分为6份备用。

（3）制作大鼠肝脏组织的石蜡切片：将步骤（2）中的健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织，先用生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净；再将肝脏组织切成块状，并用固定液进行固定；对块状大鼠肝脏组织块进行脱水、透明、透蜡及包埋；使用切片机将包埋后的大鼠肝脏组织进行切片，用蒸馏水将切片贴于干净无油的玻片上，在酒精灯上进行烘烤，使得玻片展平；将贴好切片的玻片置于60℃恒温箱内2 h，使得蛋白质凝固，制作成健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片。

（4）大鼠肝脏的HE染色：取步骤（3）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片各一份放入苏木色精中染色约10-30 min；用自来水流水冲洗15 min，冲洗过程中，切片颜色发蓝；将切片放入1%盐酸酒精液中褪色，见切片变红，颜色较浅时即可，用0.5%伊红酒精液对比染色2-5 min。