[发明专利]一种环状哑铃形探针及其应用

说明书

本发明公开了一种环状哑铃形探针及其应用，本发明设计了两种环形哑铃状探针，然后再利用此探针进行链杂交反应扩增检测待测目标物的浓度并应用于细胞内靶序列的原位成像。该方法较现有的链杂交扩增方法克服线性探针或发夹探针在细胞内易水解的缺陷，发现了环形核酸探针有强的耐水解性能，并将环形探针结合链杂交反应用于活细胞内靶序列成像降低了假阳性和背景信号，提高了检测准确度。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种环状哑铃形探针及其应用。

背景技术

MiRNA是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA(18-24)碱基)。它在动植物生长、发育、分化和生殖等过程中发挥着重要作用。人类约30％的基因受miRNA调控，且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。对miRNA的定量检测有助于深入理解其作用机制，对疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。由于miRNA的序列短，在细胞或者体液内的表达水平非常低、易降解且同源miRNA之间仅相差1-2个碱基，一般方法难以实现检测；另一方面由于microRNA与疾病的发生发展有密切关系，活细胞内microRNA的原位检测有助于实时的了解疾病的发展过程，然而大多数方法难以实现在活细胞内实时检测microRNA，因此，开发高选择性高灵敏度的原位检测活细胞内microRNA的方法是一个大的挑战。Northern印迹技术是当前分析miRNA的标准方法，但是该方法操作繁琐、耗时长、灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对RNase污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。Microarray方法可实现高通量、多组分同时检测miRNA，但该方法的特异性低、灵敏度低难以解决，并且微阵列芯片的制作和检测费用很高。RT-PCR是检测miRNA的很灵敏的方法，但是由于miRNA序列短不能直接用于PCR，需要多种技术将miRNA转换成cDNA，使该方法花费高，耗时长，同时该方法需要精确的控制各个扩增步骤的温度，使该方法的操作相当复杂。同时，上述方法都只能在体外进行microRNA的检测，无法实现活细胞内microRNA的原位检测。

杂交链反应(hybridization chain reaction(HCR))技术是由Dirks和Pierce等在2004年建立起来的一种基于两种特殊的DNA发夹设计的高效核酸扩增技术。该方法可以在恒温无酶条件下对核酸进行简单高效的扩增。一般可对目标核酸放大10⁴-10⁶倍。与PCR扩增技术相比，HCR扩增方法不需要精确的热循环和昂贵的DNA聚合酶或切口酶。由于HCR是一个恒温的无酶参与的核酸扩增技术，是进行细胞内microRNA检测的理想方法，因此，HCR扩增反应技术已被广泛应用于核酸的细胞内成像研究。

然而，HCR反应已经被广泛用于细胞内核酸的检测，但是该方法在应用于活细胞内核酸的原位成像研究时存在的假阳性和高背景这两个缺陷大大限制了该方法的准确度。(1)传统HCR反应主要由线性探针或发夹探针作为反应物，这些探针进入活细胞后，一段时间后其3’端和5’端易被活细胞内的水解酶所识别并导致探针被水解引起假阳性。(2)传统HCR反应尤其是基于发夹探针的反应具有较慢的反应速率，一般需要反应4h才能完成，较长的反应时间将导致探针水解产生较高背景和低的信噪比同时可能导致细胞活性降低。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本申请通过设计两个抗水解能力强的稳定的环状哑铃形探针，用于检测靶序列，尤其是检测目标microRNA，该检测方法建立了一个新型的环形链杂交反应(c-HCR)，克服了传统HCR反应缺陷，建立了一种更为快速、准确的恒温链杂交扩增技术并应用于核酸的活细胞原位检测。

本发明的目的之一在于提供一种检测靶序列的环状哑铃形探针。

本发明的另一目的在于提供上述环状哑铃形探针在活细胞中原位检测靶序列的应用。

本发明所采取的技术方案是：