[发明专利]一种海藻酸裂解酶SHA-6基因及应用

说明书

本发明公开了一种海藻酸裂解酶SHA‑6基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过与pET‑32a(+)质粒重组构建并转化到大肠杆菌BL21中得到一株产海藻酸裂解酶SHA‑6的工程菌，对该菌株进行诱导表达产生大量包涵体蛋白SHA‑6，将海藻酸裂解酶SHA‑6包涵体进行蛋白纯化及复性，使包涵体恢复活性；复性后的海藻酸裂解酶具有广泛的底物特异性，既能利用聚甘露糖醛酸PolyM也能利用聚古洛糖醛酸PolyG为底物，酶活达到13.5U/mg，是一种具有广泛应用前景的海藻酸裂解酶。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及海藻酸裂解酶SHA-6基因及其工程菌株和在制备海藻酸裂解酶中的应用。

背景技术

海藻酸是由褐藻和有限的革兰氏阴性细菌产生。它们由任意分布的均聚组块poly-β-（1→4）-D-甘露糖醛酸和poly-α-（1→4）-L-古洛糖醛酸以及两种单体随机排列形成的杂聚组块。由于它的粘性和凝胶性能，海藻酸被广泛用于食品和药物产业。最近，海藻酸在生物乙醇生产上的应用受到了持续的关注。

海藻酸是一种天然高分子化合物，可通过一系列方法将其降解。目前降解海藻酸的方法一般有三种：化学降解法、物理降解法和生物学降解法。目前生物降解法是该领域的主要研究方向之一。海藻酸裂解酶通过β-消除反应破坏海藻酸线性化合物上两个糖醛酸之间的1-4糖苷键，降解产物为不饱和寡糖，是一种条件温和、可控性强和特异性高的降解方法，可大大提高低聚糖片段制备的目的性和产率。这些酶促降解产物有许多生物活性功能，比如促进双歧杆菌的的生长活动、单核细胞的细胞因子诱导活性、抗氧化活性、内质网和线粒体介导的凋亡细胞的死亡、氧化应激保护反应和植物根系生长促进活动。海藻酸裂解酶已经在海藻酸低聚糖生产、褐藻原生质体的制备、分析海藻酸结构和囊性纤维化管理上得到应用。

从菌株Marinicatena alginatilytica SH-52中已发现了5种海藻酸裂解酶，这些酶通过异源表达后，菌体破碎离心后的上清液中分离得到，这些酶基因诱导表达后表达量低，且经过分析这类酶基因只有一个结构域，至今还未发现异源表达离心后的沉淀中存在海藻酸裂解酶，也未见相关这类型酶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的海藻酸裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本海藻酸裂解酶SHA-6基因来源于Marinicatena alginatilytica SH-52（保藏编号为CCTCC NO：M013073，该保藏菌株在本申请日之前已经在其它专利申请中公开过）；该基因编码的蛋白包含两个结构域，即AlgLyase Superfamily（海藻酸裂解酶超家族结构域）和Heparinase II/III-like protein（类肝素酶II/III结构域）。

本发明的另一目的是提供一株产海藻酸裂解酶SHA-6的工程菌株，将含有上述的海藻酸裂解酶SHA-6基因的重组质粒pET-32a-SHA-6构建于大肠杆菌中获得的重组菌株，具有产海藻酸裂解酶SHA-6的能力。

本发明的另一个目的是将上述工程菌株应用在制备具有活性的海藻酸裂解酶SHA-6中，该工程菌经IPTG诱导产生海藻酸裂解酶SHA-6包涵体，对该包涵体蛋白进行变性、纯化和复性，使蛋白包涵体产生活性。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、Marinicatena alginatilytica SH-52海藻酸裂解酶基因的SHA-6基因的获得和原核表达载体的构建

（1）根据Marinicatena alginatilytica SH-52海藻酸裂解酶SHA-6基因编码框序列和原核表达载体pET-32a多克隆位点，设计一对特异引物如下：