[发明专利]一种纳米纤维固定化酶载体的制备及应用

说明书

本发明公开了一种纳米纤维固定化酶载体的制备方法及应用，涉及基因工程、酶工程技术领域。通过将载体结合蛋白与curli纤维蛋白基因融合，克隆到大肠杆菌体内进行表达，获得改造的curli纳米纤维。改造后curli纳米纤维上自身的载体蛋白可特异性识别载体结合蛋白将目的酶蛋白定向锚定在curli纤维上，获得固定化酶。本发明的优点是该固定化酶载体原料易得、成本低廉、制备过程简单、强度高、通用性高、比表面积大、与酶亲合力强。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，发明了一种改造和制备curli纳米纤维的新型载体的方法，用于酶的固定化。

背景技术

酶是一种可以高效控制特定化学反应的生物催化剂，在实际应用中通常将酶作固定化处理。固定化酶由于其高稳定性、可重用性、易分离等性质被广泛地应用于化学、生物、农业和医药等领域。酶固定化方法主要包括物理吸附法、共价结合法、包埋法和交联法。制备固定化酶过程中所采用的固定化技术、载体、介质条件和所催化反应类别会在一定程度上导致酶失活、变性，从而使酶的催化性能或保留活性降低，其中载体所带来的分配效应、空间障碍效应和扩散限制效应是影响固定化酶催化效率的主要因素，因此探寻可行、有效的固定化载体来增强固定化酶的催化性能一直是固定化酶研究的热点。

纳米尺度的材料由于具有特殊的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等，在声、光、电、磁、热性能方面呈现出了新的特性，在全球范围内引起了科学和产业界的极大关注。与传统大尺寸材料相比，纳米材料还具有大比表面积、表面易于修饰、与酶分子尺寸相近等优点，作为一种新型的酶固定化载体在生物技术领域得到了广泛关注。

curli纳米纤维约4～12nm宽，是高度折叠的CsgA蛋白自组装于细胞膜上的纤维状蛋白多聚体，作为细胞膜的组成成分，与粘接宿主细胞、细胞间沟通及完成菌落行为等功能相关。近年来，人们发现利用基因工程技术可以赋予curli纳米纤维可作为许多特性，使之成为自组装材料工程的理想平台。curli纤维具有如下特征：curli纳米纤维是通过单个蛋白自组装方式构建的，通过基因手段易于改造；curli纳米纤维具有良好的刚度和柔韧性，能抵抗高温高压等恶劣条件。尽管能够产生细胞外功能淀粉样纤维的细菌种类很多，目前大肠杆菌基因工程菌是curli系统的最佳研究对象，因此它能作为研究自组装材料工程的理想平台。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于提供一种新的纳米纤维固定化酶载体制备方法及其应用。

具体的，本发明方案为：

一种纳米纤维固定化酶载体的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：

(1)合成CsgA基因和载体结合蛋白Tag基因的融合基因CsgA-Tag；

(2)分别使用DNA限制性内切酶对表达载体pET22b和融合基因CsgA-Tag进行双酶切，再使用DNA连接酶对载体和片段进行连接，得到CsgA-Tag融合基因表达载体pET22b-CsgA-Tag；

(3)使用热激法生物纳米纤维基因表达载体转化到△csgA大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆，得到表达CsgA-Tag的大肠杆菌基因工程菌A；

(4)将所述的大肠杆菌基因工程菌A以1％～5％接种量接种到LB液体培养基，并加入IPTG诱导表达12～24h，收集菌体，使用缓冲液洗涤，即获得改造的纳米纤维固定化酶载体；

(5)合成并克隆酶-Catcher蛋白基因于大肠杆菌BL21(DE3)中，方法如步骤(1)～(3)，得到表达酶-Catcher的大肠杆菌基因工程菌B；

(6)将所述的大肠杆菌基因工程菌B以1％～5％接种量接种到LB液体培养基，并加入IPTG诱导表达4～10h，收集菌体，使用缓冲液洗涤，超声破碎细胞，离心取上清，即获得含酶-Catcher的粗酶液；