[发明专利]猫杯状病毒荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法在审
| 申请号： | 201810067151.7 | 申请日： | 2018-01-24 |
| 公开（公告）号： | CN108362877A | 公开（公告）日： | 2018-08-03 |
| 发明（设计）人： | 吴培星;韩涛;宋楠;付军权;李纯玲;张继瑜 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所;北京天之泰生物科技有限公司;北京天恩泰生物科技有限公司 |
| 主分类号： | G01N33/569 | 分类号： | G01N33/569;G01N33/533 |
| 代理公司： | 北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司 11129 | 代理人： | 吴泳历 |
| 地址： | 730050 甘*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 猫杯状病毒 荧光免疫层析 检测试纸条 层析膜 结合垫 吸水垫 背衬 层析 可用 制备 荧光微球标记抗体 现场快速检测 动物病毒 检测技术 结合垫层 液体样品 依次设置 灵敏度 垂直的 对照线 复合物 检测线 检测 预防 | ||
1.一种猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：
包括背衬以及在背衬上依次设置的结合垫、层析膜以及吸水垫，构成可使样品从结合垫层析到吸水垫的层析路径；
所述结合垫上结合有荧光微球标记抗体复合物；所述层析膜上设置有与所述层析路径垂直的检测线和对照线；
所述荧光微球标记抗体复合物是荧光微球与兔抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗体的偶联物；
所述检测线由羊抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)多克隆抗体包被而成,所述对照线由葡萄球菌蛋白(Staphylococal Protein A，SPA)包被而成；
所述荧光微球粒径为180-240nm。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述结合垫上，所述荧光微球标记抗体复合物的包被密度：以兔抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗体质量计为7.5ug/每平方厘米。
3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记抗体复合物是通过如下步骤制备而得：将荧光微球与兔抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗体以2～6mg：1～3mg的比例，优选2～5mg:1mg，2～4mg:1mg或3mg:1mg的比例，进行偶联反应制得。
4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记抗体复合物是通过如下步骤制备而得：向pH5.0，浓度0.02mol/L的PBS溶液中依次加入所述荧光微球、加入浓度为10mg/ml的EDC溶液，再加入兔抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗体，室温下缓慢搅拌2h，加入终浓度为2％的BSA溶液封闭30min后，以10000r/min、4℃离心10min，移出上清液，所得沉淀中即含有所述荧光微球标记抗体复合物。
5.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球的粒径210nm。
6.根据权利要求1-5任一所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球为稀土铕荧光微球。
7.根据权利要求1-5任一所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条宽度为3mm，所述检测线和对照线的宽度也为3mm；所述检测线上，所述的羊抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)多克隆抗体包被量为0.5ug/条,所述的葡萄球菌蛋白包被量为0.3ug/条；优选地，检测线和对照线相距5mm。
8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，
所述结合垫的上游还设置有样品垫；用于接收样品，并将样品中的物质输送到结合垫上；
优选地，还包括外壳，所述外壳对应所述样品垫的位置有开口，对应检测线和质控线的位置设置为透明或开口结构。
9.权利要求1-8任一所述的猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括
制备所述荧光微球标记抗体复合物：将荧光微球与兔抗猫杯状病毒(Felinecalicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗体以2～6mg：1～3mg的比例，优选2～5mg:1mg，2～4mg:1mg或3mg:1mg的比例，进行偶联反应；
将荧光微球标记抗体复合物溶液以5ul/cm喷在结合垫上，真空抽干；
将结合垫，层析膜，吸水垫依次装配到试纸条底衬上。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括将浓度为2mg/ml的羊抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)多克隆抗体和浓度为1mg/ml的葡萄球菌蛋白分别包被在层析膜上,形成相距5mm的所述检测线和所述对照线；
优选地，所述荧光微球标记抗体复合物的制备步骤如下：向pH5.0，浓度0.02mol/L的PBS溶液中依次加入所述荧光微球、加入浓度为10mg/ml的EDC溶液,再加入兔抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗体,室温下缓慢搅拌2h，加入终浓度为2％的BSA溶液封闭30min后，以10000r/min、4℃离心10min，移出上清液，所得沉淀中即含有所述荧光微球标记抗体复合物；
优选地，在将所述荧光微球标记抗体复合物碰到结合垫之前，先采用pH8.2，含2％吐温的浓度为0.05M的硼酸缓冲溶液浸泡处理结合垫；
优选地，还包括制备兔抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗体：用纯化的猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白免疫家兔,采血并分离血清,FCV F-ELISA检测抗体效价,若效价达到1:5000以上,通过颈动脉放血,分离血清,灭活后用抗体纯化柱对多克隆抗体进行纯化,用PBS稀释至1mg/ml；
优选地，还包括羊抗猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)多克隆抗体的制备:用纯化的猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)免疫绵羊,经耳静脉采血并分离血清,用FCV-ELISA检测抗体效价,若效价达到1:5000以上,通过颈动脉放血,分离血清,灭活后用抗体纯化柱对多克隆抗体进行纯化,用PBS稀释至2mg/ml。
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