[发明专利]CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备

权利要求书

1.CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，其特征在于：将模板蛋白固定于96孔微板，接着通过控制聚合时间制备一层厚度可控的蛋白质分子印迹膜，用于印迹模板蛋白，模板蛋白经洗脱形成分子印迹膜；并通过CuO标记信号转换技术对分子印迹膜识别的目标蛋白进行直接标记，经转换成Cu²⁺可直接电化学分析，从而构建一种电化学仿生传感器；所述CuO标记信号转换技术，包括以下几个步骤：

1）CuO NPs的制备：取1 mmol醋酸铜，2 mmol冰醋酸，依次溶解到100 mL的无水乙醇中，充分混匀并水浴加热到78℃，接着在磁力搅拌下，往混合液中加入4 mmol NaCl粉末，78℃下反应1小时，然后将所制备的CuO NPs悬浊液离心10 min，弃上清液，依次用乙醇、超纯水清洗沉淀数遍，60℃恒温干燥24 h；

2）目标蛋白的孵化：将目标蛋白稀释一定浓度，于制备好的印迹聚合物膜的96孔板中，每孔加入50 μL，孵育一定时间，然后吸尽板孔中的蛋白液体，加入100 μL超纯水，反复两次；

3）CuO NPs颗粒标记：配制一定质量浓度的CuO NPs悬浊液，超声分散；然后每孔加入30μL，孵化一定时间，吸尽板孔中的CuO NPs悬浊液体，加入100 μL超纯水，反复洗涤两次；

4）Cu²⁺的电化学检测：每孔加入30 μL一定浓度的HCl溶液，将孔板溶液静置2~3 min以确保CuO NPs充分溶解，转换成轻Cu²⁺，然后进行电化学检测；所述的步骤2）中，目标蛋白的浓度范围为0~0.5 μg/mL，孵育时间为20 ~80 min；步骤3）中，CuO NPs悬浊液的浓度为2~10mg/mL，孵化时间为10~60 min；步骤4）中，HCl的浓度为0.1~2 mol/L。

2.根据权利要求1所述的CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，其特征在于：所述厚度可控的蛋白质分子印迹膜的制备，具体步骤如下：

1） 模板分子的固定：取洁净的96孔微型板，每孔加入50 μL 100 μg/mL的模板蛋白，振晃孵育1小时；接着吸尽板孔中蛋白液体，加入100 μL超纯水清洗，每次浸泡5 min，反复二次；

2）聚合物薄膜的制备：取一定浓度的苯胺作为功能单体，过硫酸铵APS为引发剂，苯胺与APS的摩尔比例为3∶1，在试剂管中先进行预聚合，以确保混合完全，并迅速加入板孔中，每孔加入80 μL，孵育一定时间，孵育过程适当的振晃以避免聚合物分层，同时促进聚合完全，反应过程中控制聚合时间，以制备符合要求的聚合物膜；

3）模板蛋白的洗脱：吸尽板孔中未反应完全的溶液，每孔加入100 μL超纯水，洗涤两次；加入100 μL 一定浓度的 NaCl溶液洗脱模板蛋白，孵化洗脱120min，再加入300 μL超纯水清洗5次；

步骤2）中聚合物膜孵育时间为5 ~50 min，不同蛋白因结构、空间大小不一，聚合时间也有所不同；

所述的苯胺的浓度为0.003 ~0.6 mol/L；

所述的过硫酸铵APS的浓度为0.001 ~0.2 mol/L；

NaCl溶液的浓度为0.1 ~2 mol/L。

3.根据权利要求2所述的CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，其特征在于：所述的模板蛋白为胰蛋白酶Try、牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA、牛血红蛋白BHb、溶菌酶Lyz中的一种。