[发明专利]蛋白、跨膜核酸解旋纳米孔及其构建方法与应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白、跨膜核酸解旋纳米孔及其构建方法与应用。本发明要解决的技术问题是克服现有的小孔径蛋白纳米孔在转运双链核酸时需要外接解旋活性组件的不足。本发明解决上述缺陷的技术方案是提供了牛乳头瘤病毒双链DNA解旋酶蛋白的截短体E1‑1(306‑577)蛋白和E1‑2(306‑605)蛋白及其变体，以及其同源蛋白的变体可以用于制备含导电通道膜，为本领域提供了一种新的有效选择。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白、跨膜核酸解旋纳米孔及其构建方法与应用。

背景技术

对于生物和化学活性物质的高精准检测是长久以来工业和科研领域共同关注的目标之一，而这需要强健和稳定的传感装置，从α溶血素α-HL蛋白第一次应用于单分子检测领域开始，纳米孔作为一个单分子检测的技术平台已经越来越在发挥着重要的作用。

通过分子与分子间的亲和作用(如共价结合或非共价吸引)来结合或“捕获”检测感兴趣的分析物，如组氨酸插入α-HL的β桶状区来特定区分量化镍、铜、以及锌等二价金属离子；利用基因工程手段在孔内腔部位嵌入特殊的配体分子来检测小的有机分子甚至蛋白质片段；在α-HL孔道的117号半胱氨酸上结合铜离子来区别氨基酸构型。

除了α-HL以外，已经研究的其他蛋白质通道包括用于检测聚乙二醇的阿拉霉素、当下被广泛应用于高通量核酸测序研究的耻垢分枝杆菌重组蛋白MspA，以及孔道直径在3.6nm允许双链通过的噬菌体phi29DNA包装马达蛋白等。α-HL和MspA这类蛋白纳米孔通常需要其他酶的辅助来完成待测物的检测，限制了其更广泛的应用。

对于α-HL纳米孔，从已有的研究报道看，其跨膜β桶状区的直径最小处约1.5nm，但其长度在5.2nm左右，在利用该纳米孔做测序或其他小分子传感研究时，由于孔道最窄处的长度太长而无法使核酸链通过孔道做棘轮运动，即难以完成单碱基的区分，对其他小分子的传感分辨率也因此降低。

而MspA虽然跨膜区段长度较α-HL短，但由于其通常只具备纳米孔的功能，在分子传感方面仅相当于人工碳纳米管，作为一个离子流通道而存在，譬如Ian M、Elizabeth等人利用MspA偶联Hel308解旋酶或者Φ29DNA聚合酶在核酸链中区分单核苷酸的差异。

而Phi29包装马达蛋白由于自身不良的电压门控特性，在微量检测时电信号容易收到较强干扰。

本领域研究人员正在用其他材料诸如合成类金属或硅纳米孔潜在的应用于DNA测序，但是这种合成纳米孔目前仍不具备可靠的生产具有一致性质的重复结构能力，并且在化学修饰孔道方面缺乏多样性。所以对寻找更优良的蛋白质纳米孔或其替代物，仍是本领域的研究热点与难点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的小孔径蛋白纳米孔在转运双链核酸时需要外接解旋活性组件的不足。

本发明解决上述缺陷的技术方案是提供了一种单体蛋白。该单体蛋白：(1)为分离的牛乳头瘤病毒双链DNA解旋酶的306-577位氨基酸构成的蛋白，其序列为SEQ ID No.3所示；

或(2)：在为(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入至少一个氨基酸所得的变体。

进一步的，本发明的单体蛋白为所示(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入1～20个氨基酸所得的变体。

优选的，为所示(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入1～15个氨基所得的与(1)限定的变体。

进一步的。上述蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.3所示的蛋白经过取代和/或缺失和/或插入不多于10个氨基酸所得的与该单体蛋白功能相同或相似的蛋白。

更优选的，为所示(1)限定的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或插入1～10个氨基所得的与(1)限定的变体。