[发明专利]利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法(利用病毒载体提高植物抗黄萎病抗性的方法)：利用植物病毒载体在植物体内特异表达针对大丽轮枝菌多个致病关键基因的小干扰RNA，从而多靶点抑制大丽轮枝菌侵染，提高植物对于黄萎病抗性。本发明对棉花叶皱缩病毒载体进行改造，插入多个大丽轮枝菌致病关键基因片段，从而实现了棉花体内表达针对大丽轮枝菌致病关键基因的多靶点小干扰RNA，下调其致病关键基因的表达量，抑制大丽轮枝菌侵染，达到提高棉花黄萎病抗性的目的。本发明可用于提高植物抗真菌病害抗性和研究植物抗病性育种。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法，即，涉及利用病毒载体提高植物黄萎病抗性的方法及应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(VIGS)现象是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒入侵植物时，病毒基因组转录产生病毒来源的RNA(vsRNA)被植物细胞防御机制中一些蛋白所识别，经过RNA-dependent RNA Polymerase 6(RDR6)复制，使原本单链的vsRNA形成了双链RNA(dsRNA)。该dsRNA在植物体内迅速被Dicer-like(DCL)的RNaseIII酶切割形成大小约为21-24nt的short interfering RNA(siRNA)，siRNA与Argonaute(AGO)RNA结合蛋白以及其他RNase结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，这一RISC复合体能够特异地与同源的靶标mRNA结合，并降解这些靶标mRNA，从而达到抗病毒的目的。利用这一机制，我们可以在病毒侵染性克隆上插入植物内源的基因片段，当该病毒侵染植物时，诱发VIGS反应，从而可以特异沉默植物内源基因的表达。

寄主诱导的基因沉默(HIGS)是在VIGS的基础上进一步发展，将含有特定病原物靶基因相关片段转染或转化到寄主体内，产生相应的小干扰RNA(siRNA)。当寄主遭受该病原物侵染时，病原物相应的基因表达就会受到这些小干扰RNA的调控，其积累量就会下调，减轻病害影响。

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，是棉花上的重要病毒之一，对棉花的生产有着严重威胁。

大丽轮枝菌侵染棉花引起的棉花黄萎病是农业生产中毁灭性真菌病害，被称为棉花的“癌症”，给世界棉花生产带来巨大威胁。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法，即，提供利用病毒载体提高棉花抗黄萎病抗性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法(利用病毒载体提高植物抗黄萎病抗性的方法)：利用植物病毒载体在植物体内特异表达针对大丽轮枝菌多个致病关键基因的小干扰RNA，从而多靶点抑制大丽轮枝菌侵染，提高植物对于黄萎病抗性。

作为本发明的利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法的改进：