[发明专利]一种双因子程序释放的仿生取向软骨支架及其制备方法

权利要求书

1. 一种双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，是以胶原、壳聚糖为主要原料，分别与透明质酸、负载KGN的PLGA微球及丝素蛋白、负载TGF-β1的PLL-HS纳米粒配合制备表面层复合材料和移行层复合材料，再以丝素蛋白为粘合剂将两者粘合，制得具有上下双层结构的仿生取向软骨支架，其特征在于：包括如下步骤：

一、表面层复合材料的制备

（1）分别将胶原、壳聚糖溶于冰醋酸，制成胶原溶液和壳聚糖溶液；

（2）将透明质酸溶于水中制成透明质酸溶液；

（3）将步骤（1）所得胶原溶液与壳聚糖溶液漩涡搅拌混合均匀；

（4）将步骤（2）所得透明质酸溶液缓慢加入步骤（3）所得混合液中，混合均匀；

（5）将步骤（4）所得混合溶液磁力搅拌过夜，经冷冻干燥后添加交联剂进行交联；

（6）将交联后的产物用蒸馏水反复冲洗至中性，二次冷冻干燥后即得冻干的表面层复合材料；

（7）制备负载KGN的PLGA微球；

（8）将步骤（7）制备的负载KGN的PLGA微球用注射器均匀注射到冻干的表面层复合材料中，并再次冻干，得表面层复合材料；

（9）将步骤（8）所得表面层复合材料用打孔器制成直径5 mm、高2 mm的圆柱体；

二、移行层复合材料的制备

（10）另取胶原、壳聚糖分别溶于冰醋酸，制成胶原溶液和壳聚糖溶液；

（11）制备丝素蛋白；

（12）将步骤（10）所得胶原溶液与壳聚糖溶液漩涡搅拌混合均匀，然后置于磁力搅拌器上缓慢搅拌；

（13）将步骤（11）所得丝素蛋白缓慢加入到步骤（12）所得混合液中，混合均匀；

（14）制备负载TGF-β1的PLL-HS纳米粒；

（15）将步骤（14）制备的负载TGF-β1的PLL-HS纳米粒加入到步骤（13）所得混合液中均匀混合；

（16）将步骤（15）所得混合溶液磁力搅拌2小时，然后注入到模具中并缓慢竖直放入液氮中冷冻过夜；

（17）将步骤（16）冷冻干燥后的产物于交联剂中进行交联；

（18）将交联产物用蒸馏水反复冲洗至中性，二次冷冻干燥后即得移行层复合材料，然后将其切割成长4 mm的柱状；

三、软骨支架的制备

（19）将步骤（9）所得圆柱体状表面层复合材料和步骤（18）所得柱状移行层复合材料用丝素蛋白进行粘合，40℃烘干，即为双因子程序释放的仿生取向软骨支架。

2.根据权利要求1所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：所述胶原来源于鱼皮、猪皮、牛皮或牛腱；所述丝素蛋白从蚕茧中获得。

3. 根据权利要求1所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：表面层复合材料的制备中，所用胶原溶液的浓度为0.6 wt%、所用壳聚糖溶液的浓度为1wt%，所用透明质酸溶液的浓度为1 wt%；三者混合的体积比为1~10:10:1~10。

4.根据权利要求1所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述交联剂是将2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺溶于体积浓度为40%的乙醇溶液中制得；

其中2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为50:33:8；

5. 根据权利要求1所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤一所得表面层复合材料中负载KGN的PLGA微球的含量为0.03 wt%。

6. 根据权利要求1所述的双因子程序释放的仿生取向软骨支架的制备方法，其特征在于：移行层复合材料的制备中，所用胶原溶液的浓度为0.6 wt%、所用壳聚糖溶液的浓度为1wt%、所用丝素蛋白的浓度为1.343 wt%；三者混合的质量比为1:1:0~3。