[发明专利]和牛三元杂交牛CAPN1基因A316G突变位点检测方法及其应用

说明书

本发明提供一种和牛三元杂交牛CAPN1基因A316G突变位点检测方法及应用。本发明检测方法以待测牛全基因组DNA为模板，采用T‑ARMS‑PCR引物组合，通过PCR扩增牛CAPN1基因片段；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定所述CAPN1基因单核苷酸多态位点的基因型。所述T‑ARMS‑PCR引物组合包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列组成的特异性外引物，和SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列组成的位点特异性引物。本发明针对和牛三元杂交牛CAPN1基因A316G突变的四引物扩增受阻突变体系PCR(T‑ARMS‑PCR)检测方法，通过特殊设计的引物经PCR扩增后再经琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确的检测该位点的单核苷酸的多态性，从而有利于辅助优质杂交牛的早期筛选，辅助提高肉质性状优良的和牛三元杂交牛选择的准确性。

技术领域

本发明属于动物育种分子生物检测领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测和牛三元杂交牛钙激活中性蛋白酶1基因C/G颠换的单核苷酸多态性(SNP)的四引物扩增受阻突变体系PCR(T-ARMS-PCR)方法。

背景技术

现有研究表明利用日本黑毛和牛做终端父本、以利杂牛(利木赞与鲁西牛杂交)、西杂牛(西门塔尔与鲁西牛杂交)、夏杂牛(夏洛莱与鲁西牛杂交)为母本杂交的和牛三元杂交牛既保留了母牛群体易饲养，适应性强的特长，又继承了父本和牛的肉大理石花纹明显、肉质好的特点(成海建等.日本黑毛和牛三元杂交阉牛育肥试验初报.中国牛业科学2016，42(3)：1-3；21)。

肉质性状是肉用牛重要经济性状，主要包括肌肉嫩度、pH值、肌内脂肪含量、系水力等。肉质对肉产品的价格和生产的经济效益具有显著的影响。为了改善肉质，科研人员和生产者进行了大量的研究。钙蛋白酶(CAPN)是钙蛋白酶水解系统家族中的一员，钙蛋白酶与是降解肌原纤维蛋白的主要酶之一，该酶活性的调节与肉嫩度的变化有关。体外试验表明，钙蛋白酶能降解肌原纤维蛋白，肉牛被屠宰后，随着ATP的消耗，肌质网小泡体内积蓄的钙离子被释放出来，激活了钙蛋白酶，分解肌原纤维蛋白促进肉的嫩化。目前，大量研究表明CAPN1 基因与肉牛宰后肌肉成熟嫩化相关，尤其是位于外显子9的G/C之间的颠换，导致了蛋白质多肽链中第316位氨基酸在甘氨酸和丙氨酸之间变动；另一个是位于外显子14的A/G之间的转换，相应的第530位氨基酸有异亮氨酸和缬氨酸两种可能性，基因CAPN316和CAPN530标记的核苷酸分别是C和G时，肉的嫩度高。由于CAPN530位存在AvaIII酶切位点，A/G突变造成酶切位点而不能产生切割片段，能够通过PCR-RFLP的方法来实现区分。

四引物扩增受阻突变体系PCR(T-ARMS-PCR)，是在扩增受阻突变体系 (ARMS)基础上发展起来并综合了四引物PCR(tetra-primer PCR)技术的优点，是一种专门用于检测单核苷酸多态性的衍生技术。该技术对单核苷酸突变检测具有快速、简便、可以区分等位基因是否纯合、以及费用低廉等特点。

T-ARMS-PCR的技术原理是利用Taq DNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，因此对于3’末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度时，3’末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，不会产生特异性扩增条带，从而表明模板DNA没有与引物3’末端相应的突变；如果PCR结果能得到特异长度的扩增条带，表明模板DNA上具有与引物3’末端相应的突变。

T-ARMS-PCR依赖引物3’端最末碱基来实现突变检测，对扩增灵敏度和准确性要求非常高。Touch down PCR(TD-PCR)是每一个(或n个)循环退火温度逐步降低1℃，直到达到一个较低的退火温度。TD-PCR前期温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率来提高扩增的特异性和扩增效率。