[发明专利]基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒，属于SNP位点检测技术领域。所述基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针，所述探针在重组酶介导的等温扩增法用探针的基础上，将四氢呋喃替换SNP位点的后一位碱基或SNP位点互补位点的后一位碱基，外切酶III酶解到四氢呋喃位点切割结束，切掉的荧光基团修饰的碱基在体系中产生荧光信号，余下的探针部分充当下游引物的作用。所述探针简化检测过程中必须下游引物组分，降低了探针与引物发生非特异性扩增。本发明提供了检测SNP位点的试剂盒，包括上游引物和所述的探针。所述试剂盒能够用于检测多种SNP位点。

技术领域

本发明属于SNP位点检测技术领域，具体涉及基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，占所有已知多态性的90％以上。SNP位点是在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。随着人类基因组计划和HapMap计划的完成，使得单核苷酸多态性(SNP)成为了第三代遗传标志。人体的许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，及时了解个体的SNP差异可以指导临床对病人采取合适的用药与治疗。此外，随着SNP位点研究的越来越广泛，SNP位点在植物中广泛存在，并且作为分子标记与某些育种相关的抗性基因紧密连锁，通过检测SNP位点快速准确得到育种抗性品种的基因型，提供为育种工作提供便利。

目前，有许多方法被用来SNP的分型，如Taqman-MGB，直接测序，限制性片段长度多态性分析法，四引物扩增受阻突变体系PCR等。但是这些方法基本上全部依赖于PCR，费时，费力，而且需要复杂的仪器设备。

近来，等温扩增技术以其不需要温度循环仪器特别适合床旁检验(POCT)的特点吸引了国内外专家的关注。其中环介导等温扩增技术(LAMP)常被用于SNP的检测，但是由于其引物设计复杂，反应温度高达60℃的特点而限制了其应用。同时，也有利用重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)来检测肿瘤基因点突变的研究报道，但是通常需要借助肽核酸，内参等方法，反应复杂，而且灵敏度和特异度也不高。重组酶介导的等温扩增法(Recombinase aided amplification，RAA)是一种新型的等温扩增方法，RAA使用从细菌或真菌中获得的重组酶，在39℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物同样以指数级增长。通常在30min内可以完成检测。同样它也可以通过添加带有荧光标记的探针来检测产物的实时扩增。尽管RAA检测方法具有较高的灵敏度和特异度，但是传统的RAA检测方法依赖于设计一对扩增引物和一条探针，而且避免引物产生非特异性扩增及引物与探针的非特异性结合，这对引物和探针的要求较高，同时目前也尚无利用该方法做SNP位点研究的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒，所述探针既可以作为探针产生荧光信号使用，又可以作为引物使用，简化RAA检测方法所需引物组分。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：