[发明专利]一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法

说明书

一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对双芽巴贝斯虫的RAP‑1为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有PCR检测技术在诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫时，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于牛双芽巴贝斯虫病精准检测，应用前景广阔。

技术领域

本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法。

背景技术

牛双芽巴贝斯虫是一类经蜱传播，红细胞内寄生的血液原虫，由该类寄生虫引起的巴贝斯虫病，是一种急性过程的季节性疾病，在世界上许多地区发生和流行，我国各地也常有发生，给畜牧业和国民经济造成巨大损失。牛感染该虫后，常出现贫血、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状，严重影响牛的健康。该病已经造成了巨大的经济损失，并呈世界范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。牛双芽巴贝斯虫是经蜱传播的一种血液原虫，寄生于哺乳动物红细胞、淋巴细胞和其他细胞中，也可以寄生在蜱的各种组织细胞中。双芽巴贝斯虫寄生于黄牛、奶牛、水牛和瘤牛的红细胞内，由微小牛蜱和扇头蜱等多种蜱经卵传播。双芽巴贝斯虫的临床诊断最基本的方法是血液涂片镜检，但是该方法只能用于对发病牛的检测，但对疫病普查和进出口检疫则有困难，因为发病牛只痊愈后很难查到虫体。血清学检查也是牛双芽巴贝斯虫流行病学研究行之有效的方法，但是该类方法不能区别动物是正处于感染中还是已经感染耐过，不能鉴定带虫动物以及贮存宿主。敏感性更高的方法，例如常规PCR 检测技术也是诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫最常用的方法，但是该方法具有很大的一个缺点-低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、蜱虫体内双芽巴贝斯虫含量较低时容易漏检。而且在检测牛双芽巴贝斯虫的过程中发现，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应。敏感性和特异性更高的方法，例如反向线性斑点杂交技术(RBL)以及PCR-ELISA等也已经见诸于报道，但是这些方法都存在假阳性率高的缺点。

巢式PCR使用两套引物通过两轮PCR反应扩增靶基因DNA片段，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物结合在第一次PCR产物内部，反应特异性强、敏感性高。nPCR检测技术已广泛应用于病原体检测。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了一种双芽巴贝斯虫巢式 PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，建立一种精准、高效、实用的DNA检测方法。针对双芽巴贝斯虫的RAP-1为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，提供了一种双芽巴贝斯虫的nPCR特异性引物及检测试剂盒与nPCR检测方法，该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病精准检测，应用前景广阔。

该方法可用于双芽巴贝斯虫病流行病学调查及快速检测。

本发明采用的技术解决方案是：一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物，包括设计的两对特异性引物，具体为：

引物BF1：5＇-CAT-CTA-ATT-TCT-CTC-CAT-ACC-CCT-CC-3′；

引物BR1：5＇-CCT-CGG-CTT-CAA-CTC-TGA-TGG-CAA-AG-3′；

引物BF2：5′-CGC-AAG-CCC-AGC-AGG-CCC-CGG-TGC-3′；

引物BR2：5′-CCG-ACC-TGG-ATA-GGC-TGT-GTC-ATG-3′。

一种双芽巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：

(一)权利要求1所述的两对特异性引物；