[发明专利]一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种立克次氏体巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：

外引物EF1∶5′-TTT-CCC-TAT-GAT-ACA-GAA-GGT-AAC-3′；

内引物ER1：5′-AAA-GCA-AGG-ATT-GTG-ATC-TGG-ACC-3′；

外引物EF2：5′-ACT-AGT-AGA-AAT-TGC-ACA-ATC-TAT-3′；

内引物ER2：5′-TGA-TAA-CTT-GGT-GCG-GGA-AAT-CCT-T-3″。

2.一种立克次氏体巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：

(一)权利要求1所述的两对特异性引物；

(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含立克次氏体993bp基因片段；

(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；

(四)Taq酶。

3.根据权利要求2所述的立克次氏体巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。

4.一种采用权利要求1所述的特异性引物的立克次氏体巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)被检标本DNA提取：取花蜱数只，酒精清洗，每只蜱放入单独的1.5ml EP dof管，200μL PBS液浸没蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；

(2)以权利要求1中的外引物EF1、ER1扩增：在EP dof管中加入处理后的蜱标本DNA，同时设阴、阳性对照，10×PCR Buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶，25pmol/μL EF1，25pmol/μL ER1，DNA模板，ddH2O混匀后稍离心的50μL反应体系中进行第一轮PCR；

(3)以权利要求1中的内引物EF2、ER2扩增：以第一轮PCR产物DNA为模板，以EF2、ER2为第二套引物，在10×PCR Buffer 5μL，Mgcl2 2μL，dNTP 4μL，Taq酶0.5μL，25pmol/μL EF2 1μL，25pmol/μL ER2 1μL，DNA模板2μL，ddH2O 34.5μL混匀后稍离心的50μL反应体系进行第二轮PCR；

(4)PCR产物鉴定：取第二轮PCR产物2μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(5)测序：将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。

5.根据权利要求4所述的立克次氏体巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的第一轮PCR反应条件为：

94℃预热5min；

94℃保持lmin，55℃保持1min，72℃保持2min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。

6.根据权利要求4所述的立克次氏体巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的第二轮PCR反应条件为：

94℃预热5min；

94℃保持1min，55℃保持1min，72℃保持2min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。

7.根据权利要求4所述的立克次氏体巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中第一轮PCR 50μL反应体系中蜱样品基因组DNA模板量为5μl，10×PCR Buffer为5μL，Mgcl2为2μL，dNTP为4μL，Taq酶为0.5μL，25pmol/μL EF1为1μL，25pmol/μL ER1为1μL，ddH2O为31.5μL。

8.根据权利要求2所述的立克次氏体巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(4)中第二轮PCR 50μL反应体系中第一轮PCR产物DNA模板量为2μl，10×PCR Buffer为5μL，Mgcl2为2μL，dNTP为4μL，Taq酶为0.5μL，25pmol/μL EF2 1μL，25pmol/μL ER2为1μL，ddH2O为34.5μL。