[发明专利]一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种植物RNAi表达载体的构建方法，其特征在于，所述植物RNAi表达载体含有目的基因片段表达元件，所述目的基因片段表达元件含有CaMV35S启动子、内含子、OCS终止子、两个方向相反的Gateway盒子；所述内含子位于两个方向相反的Gateway盒子之间，用于表达发卡RNA结构中的环；所述Gateway盒子含有attR1位点、attR2位点、CmR基因、ccdB基因和一个EcoRI酶切位点，Gateway盒子用于表达方向相反的目的基因片段，构成发卡RNA结构中的臂；

所述植物RNAi表达载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：分别用EcoRⅠ和HindⅢ单酶切pHANNIBAL载体，纯化酶切后的产物，再利用高保真Taq酶补平切点，得到E片段和H片段；

步骤2：用EcoRⅤ酶切pBS-Gateway-rfA载体，回收得到Gateway盒子，所述Gateway盒子含有attR1位点、attR2位点、CmR基因、ccdB基因和一个EcoRI酶切位点；

步骤3：将步骤1中所述E片段和H片段分别与步骤2中所述Gateway盒子连接，再经筛选获得pHANNIBAL-GW1.1载体和pHANNIBAL-GW1.2载体；所述pHANNIBAL-GW1.1载体的Gateway盒子中的attR1位点与CaMV35S启动子连接，attR2位点与内含子连接；所述pHANNIBAL-GW1.2载体的Gateway盒子中的attR1位点与OCS终止子连接，attR2位点与内含子连接；

步骤4：用KpnⅠ和XhoⅠ对pHANNIBAL-GW1.1载体和pHANNIBAL-GW1.2载体进行双酶切，将从pHANNIBAL-GW1.1载体切出的含有KpnⅠ和XhoⅠ粘性末端的Gateway盒子，与用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pHANNIBAL-GW1.2载体后的片段连接，获得含有两个方向相反的Gateway盒子的重组载体pHANNIBAL-GW2；

步骤5：用SacⅠ和SpeⅠ双酶切pHANNIBAL-GW2载体，回收得到目的基因片段表达元件，然后与用SacⅠ和XbaⅠ双酶切pCAMBIA2301载体后的片段连接，得到pCAMBIA2301-GW-RNAi载体，即为植物RNAi表达载体，SpeⅠ和XbaⅠ为同尾酶，切出的粘性末端之间可以进行连接。

2.根据权利要求1所述的一种植物RNAi表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway盒子是EcoRⅤ酶切pBS-Gateway-rfA载体获得，所述EcoRⅠ酶切位点距离attR1位点453bp，距离attR2位点1257bp。

3.根据权利要求1所述的一种植物RNAi表达载体的构建方法，其特征在于，所述目的基因片段表达元件以pHANNIBAL载体为中间载体获得；所述植物RNAi表达载体以pCAMBIA2301载体为骨架，将目的基因片段表达元件插入pCAMBIA2301载体的多克隆位点中获得。

4.根据权利要求1所述的一种植物RNAi表达载体的构建方法，其特征在于，所述植物RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。