[发明专利]一种抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201835的杂交瘤细胞株HA5‑E4所分泌的。本发明针对田鼠巴贝斯虫糖代谢途径的乳酸脱氢酶LDH，该蛋白具有免疫原性，制备了针对rBmLDH的单克隆抗体；利用Western blot检测证实，该单抗能特异性地识田鼠巴贝斯虫，但不识宿主的LDH，故可应用于免疫荧光法检测感染细胞中的田鼠巴贝斯虫。

技术领域

本发明属于寄生虫病的血液原虫防治技术领域，具体涉及一株抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体及其应用。

背景技术

田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)是顶器门、孢子虫纲、梨形虫目、巴贝斯科、巴贝斯属的一种红细胞内专性寄生的血液原虫，是引发人与啮齿动物的巴贝斯虫病最主要的病原体之一，主要经硬蜱叮咬传播，也可经输血或者血液制品等途径感染及传播，呈机会性致病的特点，一般宿主则多为隐性感染，免疫力低的人或动物感染后表现出严重的临床症状，严重时可导致死亡。目前该病在全球范围内广泛流行，人感染的病例主要集中在美洲，近年来发病病例激增，在欧洲、亚洲等地方不断发现感染病例。在我国，亦有人感染田鼠巴贝斯虫的报道，这一新发人兽共患病给畜牧业和人类健康带来了威胁。人感染后可导致黄疸、稽留高热、血红蛋白尿等，对免疫缺陷的病人危害尤为严重，可导致死亡。

人和动物感染田鼠巴贝斯虫后，初期无典型的临床症状，但人和动物一旦感染，呈终生带虫免疫。迄今为止，尚无有效疫苗预防该病，也无有效药物可根治。因此早期诊断并及时治疗是控制该病的重要方法。

目前对田鼠巴贝斯虫病的检测无可用的商品化试剂盒，主要依耐于实验室检测。现阶段常用的实验室诊断方法主要有血涂片染色镜检法、实时荧光定量PCR、常规PCR和克隆测序。

血涂片染色镜检法操作简便、对仪器设备要求不高，但需要检测人员有很丰富的经验，熟悉巴贝斯虫的形态特征，检出率低，容易错检和漏检；实时荧光定量PCR、常规PCR和克隆测序方法，灵敏度和准确性均高，但需要昂贵的仪器设备，对检测人员的技术和实验技能要求高、需要良好的分子生物学基础和生物信息学基础，故难以实现临床的批量检测。因此，临床上急需一种能检测田鼠巴贝斯虫抗原的检测方法，获得特异性高亲合力的单克隆抗体是建立田鼠巴贝斯虫抗原检测方法的前提和基础。此外，单克隆抗体还可以在致病机理研究、疫苗开发等方面具有广泛的用途。

目前国外和国内均无田鼠巴贝斯虫单克隆抗体的报道，本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室的课题组选取田鼠巴贝斯虫(Babesia microti PRA-99)的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，简称LDH)基因，生物信息学分析表明该基因相对保守、具有良好抗原性，将具有更为广阔的应用前景。本发明从该指导思想出发，克隆表达了田鼠巴贝斯虫乳酸脱氢酶(BmLDH)，以重组rBmLDH免疫小鼠，获得杂交瘤细胞，筛选获得一株高亲合力的单克隆抗体，经过免疫印迹和免疫荧光实验验证该抗体特异性良好，灵敏度高，并具有田鼠巴贝斯虫检测能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型单克隆抗体，该单克隆抗体针对的是一种田鼠巴贝斯虫糖代谢途径的酶即乳酸脱氢酶，该单克隆抗体由杂交瘤细胞株HA5-E4分泌，可以特异、灵敏和稳定地识别田鼠巴贝斯虫。

本发明的技术方案如下：

本发明所用的田鼠巴贝斯虫购自美国ATCC(Babesia microti PRA-99),申请人首先克隆了田鼠巴贝斯虫的LDH基因，进而在大肠杆菌中表达，提取纯化重组蛋白rBmLDH；用rBmLDH蛋白免疫小鼠，抗体上升后，用获得的免疫鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得一株杂交瘤细胞；进一步用rBmLDH筛选，获得能稳定分泌高亲合力的田鼠巴贝斯虫单克隆抗体的杂交瘤细胞。申请人将该细胞株命名为杂交瘤细胞株HA5-E4，并于2018年1月10日送交位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：C201835。