[发明专利]一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用

说明书

本发明公开了一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR‑B基因编辑方法及应用，基因序列如SEQ ID NO.1所示；基因编辑方法包括以下步骤：步骤1：在基因序列前连接乳酸脱氢酶启动子Ldhp，形成Ldhp+CRISPR‑B；步骤2：通过酶切和连接将Ldhp+CRISPR‑B连接到线性质粒pDL278，形成CRISPR编辑载体；步骤3：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfB上游序列作为upstream；步骤4：通过聚合酶链式反应扩增敲除目的基因gtfC下游序列作为downstream；步骤5：将步骤3得到的upstream和步骤4得到的downstream连接形成同源重组模板HR‑BC；步骤6：将步骤2得到的CRISPR编辑载体和步骤5得到的同源重组模板HR‑BC转入变异链球菌中，即可实现同时编辑gtfB和gtfC；本发明可最大程度抑制变异链球菌胞外多糖的合成和生物膜的形成。

技术领域

本发明涉及基因序列，具体涉及一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用。

背景技术

龋病是人类常见的口腔疾病之一，是由致龋微生物代谢产酸所导致的慢性感染性疾病(Petersen P E,Kwan S.World Health Organization global oral healthstrategies for oral health promotion and disease prevention in the twenty-first century[J].Prvention Und Gesundheitsfrderung,2009,4(2):100-104.)；变异链球菌(Streptococcus mutans)是目前世界公认的致龋微生物之一，其致龋特性主要体现在以下几个方面：较强的产酸和耐酸能力、较强的环境适应能力、合成细胞外不可溶性多糖(Extracellular polysaccharide，EPS)以及对牙齿表面较强的粘附能力等；其中，合成胞外不可溶性多糖及粘附能力是变异链球菌区别于其它致龋性微生物的主要特征(Marsh PD.Microbiology of dental plaque biofilms and their role in oral health andcaries[J].Dental Clinics of North America,2010,54(3):441-54.)；同时，由变异链球菌合成的大量胞外不可溶性多糖还可以为牙菌斑生物膜中其它致龋微生物提供粘附位点，形成协同致龋效应；因此，如何有效抑制变异链球菌的过度生长，控制牙菌斑系统的生态平衡成为预防龋病的主要难点，而如何有选择性地有效抑制变异链球菌的生物膜形成能力，尤其是胞外多糖合成能力则成为了上述难点中的关键问题。

葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase，Gtfs)是变异链球菌重要的毒力因子；变异链球菌利用其Gtfs代谢碳水化合物产生胞外多糖，在口腔细菌对牙面的粘附及生物膜形成方面具有重要作用；相关研究表明，变异链球菌中gtfB、gtfC和gtfD基因(分别编码GtfB、Gtf C和Gtf D蛋白质，简称Gtfs)与合成胞外多糖密切相关，其中gtfB是合成胞外不可溶性多糖最主要的基因；当把Gtfs敲除后，会影响胞外基质与生物膜的形成，从而使变异链球菌生物膜形成功能不全(Koo H,Xiao J,Klein M I,et al.Exopolysaccharides Producedby Glucosyltransferases Modulate the Establishment of Microcolonies withinMultispecies Biofilms[J].)；这一研究结果提示，如果通过外源性手段特异性抑制变异链球菌Gtfs，控制胞外多糖的合成，可抑制口腔生物膜形成。