[发明专利]一种化脓隐秘杆菌的检测引物及检测试剂盒

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种化脓隐秘杆菌的检测引物及检测试剂盒。本发明针对化脓隐秘杆菌的溶血素PLO基因序列建立特异、灵敏的PCR方法，能够准确检测化脓隐秘杆菌，区分山羊脓性感染的其他病原体。本发明提供阳性对照菌和阴性对照菌供使用者确定试剂盒质量和评估方法的准确性。本发明提供的试剂盒及方法可在基层常规动物疫病诊断实验室使用，目标条带清晰易辨，1小时即可完成PCR反应，对于监控该菌的繁殖、疾病发生与流行及疾病的及时防治均具有重要意义。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种化脓隐秘杆菌的检测引物及检测试剂盒。

背景技术

化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)是革兰氏阳性短棒状杆菌，是牛、羊和猪等重要经济动物的条件性致病菌，常寄生于上呼吸道和消化道的黏膜处，可引起多种器官和黏膜的化脓性感染，给养殖业造成较大的经济损失。多数情况下，化脓隐秘杆菌感染造成慢性消耗性疾病；感染严重时，常因脓毒败血症引起死亡。此外化脓隐秘杆菌可以引起羚羊、骆驼、狗、猫、象、瞪羚、非洲大羚、鹦鹉、马、鹿、驯鹿、火鸡等多种动物感染。

化脓隐秘杆菌常与其它病原菌混合感染。本实验室对从重庆市荣昌、永川、江津、石柱、垫江、武隆、酉阳、丰都等区县养殖场的山羊淋巴结炎等化脓性样本进行细菌分离鉴定，检出率最高的是球菌，主要是酿脓葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌等，其次是杆菌，杆菌中主要有溶血性曼氏杆菌、奇异变形杆菌、化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌等。这些细菌往往有较宽的耐药谱，如何对山羊化脓性感染的病原体进行快速鉴定，为有针对性用药提供技术支撑，是急需解决的问题。

已有文献公布了化脓隐秘杆菌的PCR检测方法，常用的靶基因主要有16S rRNA基因和溶血素PLO基因。16S rRNA基因虽被用来作为细菌种属鉴定的分子靶标，但在亲缘关系近的细菌间常会交叉反应，作为诊断、检测靶基因往往会出现假阳性结果，还需要对所得产物进行序列测定和序列比对，以进一步鉴定病原体。溶血素PLO是化脓隐秘杆菌主要的毒力因子之一，所有的化脓隐秘杆菌分离株均存在PLO基因，是常用检测靶基因。在NCBI上进行BLAST搜索发现，PLO基因在化脓隐秘杆菌不同分离株中相对保守，同源性高于96％，与其它细菌无同源性；PLO蛋白质在化脓隐秘杆菌不同分离株中的同源性高于98％，与其它细菌的同源性低于67％。

本实验在检测山羊化脓性样本过程中发现，基于化脓隐秘杆菌溶血素PLO基因的建立的PCR检测方法最易与伪结核棒状杆菌发生交叉反应，从两种细菌DNA中扩增得到的片段大小往往也相近，不易区分。

发明CN 103937889B根据PLO基因建立的灵敏度更高的环介导等温扩增方法(LAMP)来检测化脓隐秘杆菌。相对PCR方法来说，用LAMP方法检测优点很明显，不需要昂贵的PCR仪、检测灵敏度高、特异性强、结果可视化等；用LAMP方法检测缺点也很明显，核酸提取、试剂加取需要洁净度、封闭的空间以防污染，试剂成本高，操作步骤多等。基层兽医站等机构现阶段已配备了PCR仪、电泳仪等设备，但基本没有配备高洁净度的实验室或降低气溶胶产生的独立空间。

为此，我们基于PLO基因建立了常规PCR检测方法并组成试剂盒，所建立的PCR方法具有特异性高、灵敏度高、耗时短的优点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种化脓隐秘杆菌PCR检测用引物对，其特异性强，能够避免与伪结核棒状杆菌等常见细菌的交叉反应。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

上述用于化脓隐秘杆菌PCR检测的引物对为上游引物F1和下游引物R1，F1的序列为SEQ ID NO:1所示，R1的序列为SEQ ID NO:2所示。