[发明专利]一种水稻叶绿体遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种水稻叶绿体遗传转化方法，包括以下步骤：步骤(1)、水稻叶绿体表达载体的构建；步骤(2)、水稻叶绿体转化和同质化筛选；步骤(3)、分子检测。本发明首次获得了同质化的水稻叶绿体转基因愈伤组织和植株材料，并得到了相关分子证据。通过筛选获得了适合于进行叶绿体转化的水稻材料，该改良具有以下特征：具有高频的再生能力；诱导产生的II性愈伤组织，在长期(大于6个月)继代培养后仍具有良好的分化能力。通过比较证明了潮霉素比常用的壮观霉素及其它筛选剂(抗生素或除草剂)更适合于作为水稻叶绿体转化的筛选剂。

技术领域

本发明涉及一种水稻叶绿体遗传转化方法。

背景技术

植物叶绿体是一种半自主性的细胞器，拥有自己的基因组，因而是可以转化的。叶绿体转化通常是基因枪法或者PEG法通过直接转化实现的，虽然有过通过农杆菌介导法转化的报道，但是没有得到重复。叶绿体转化是外源基因DNA直接输送到叶绿体，然后通过同源重组的方法把外源基因定点整合到叶绿体基因组上，是随着基因枪法的发明而逐步确立的。

叶绿体转化的研究比细胞核转化起步晚，Boynton等用野生型衣藻叶绿体DNA转化了atpB基因突变体细胞，使该突变体完全恢复光合作用能力，是叶绿体转化开始的标志。1990年Svab等实现了高等模式烟草叶绿体的稳定转化，从而开启了高等植物叶绿体转化的新纪元。到目前为止，除烟草以外，已在拟南芥、马铃薯、番茄、油菜、棉花、甘蓝、胡萝卜、莴苣、矮牵牛、大豆、杨树、甜菜、茄子和紫花苜蓿等植物上获得了稳定的叶绿体转基因植株。

然而，上述实现叶绿体转化的植物都属于双子叶植物，单子叶植物的叶绿体转化一直没有获得成功，而许多重要的作物，如水稻、玉米、小麦和高粱等，都是单子叶植物。目前仅仅在水稻上获得了非同质化的叶绿体转基因植株，要获得同质化的叶绿体转基因植株，还有很多的难关需要攻克。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种水稻叶绿体遗传转化方法，为实现水稻成功叶绿体转化和叶绿体基因工程改良在水稻育种中的应用打下技术基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种水稻叶绿体遗传转化方法，包括以下步骤：

步骤(1)、水稻叶绿体表达载体的构建；

步骤(2)、水稻叶绿体转化和同质化筛选；

步骤(3)、分子检测。

优选的是，步骤(1)之前还包括：适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立。

上述任一方案优选的是，所述适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立的方法包括：水稻幼穗愈伤组织的诱导、愈伤组织的分化愈伤组织的多轮继代培养、再生植株生根与移栽。

上述任一方案优选的是，步骤(1)中载体构建方法包括：水稻总DNA的提取、水稻叶绿体同源重组片段的获得、HPT基因密码子优化及表达框设计、线性化载体的准备、插入片段的准备、重组载体的无缝连接.

上述任一方案优选的是，所述水稻叶绿体同源重组片段的获得方法为：将提取的水稻总DNA作为PCR扩增的模板，根据Genbank上的水稻叶绿体序列设计引物OsF、OsR扩增水稻叶绿体基因组中的 16S-trnI-trnA-23S片段，作为叶绿体转化载体中的侧翼同源序列，PCR反应后筛选出重组克隆，重组质粒为pEASY Bs-Os。

上述任一方案优选的是，所述插入片段的准备：质粒DNA小量提取法提取质粒pEASY-Ossynth，将其浓度稀释后为模板，利用 TransStart FastPfu HS DNA polymerase进行PCR扩展目的片段，所获得的PCR产物回收，即为插入片段。