[发明专利]优化的谷氨酰胺转氨酶基因、信号肽及发酵方法

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及优化的谷氨酰胺转氨酶基因、信号肽及发酵方法。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～8所示。本发明通过密码子优化技术优化了来源于吸水链霉菌(Streptomyce hygroscopicus)的谷氨酰胺转氨酶基因tg，将优化后的基因tg转化至毕赤酵母获得产TG酶的重组菌，接着，通过筛选比较了不同信号肽对重组菌胞外分泌TG酶的能力，最后，优化了发酵TG酶重组工程菌的工艺参数，实现了TG酶的高效表达，为其产业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及优化的谷氨酰胺转氨酶基因、信号肽及发酵方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TG)是一种能够催化酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键的蛋白，故其能催化蛋白质分子间、分子内的交联及谷氨酰胺残基的水解，提高蛋白质的各功能，常被用作蛋白质交联剂。同时，TG酶还可将部分如赖氨酸的小分子物质引入蛋白质，增加蛋白质的营养价值。由于原生产菌株链霉菌分子改造技术困难、自身分泌蛋白量大，目标蛋白产量提高有限，难以满足市场需求，因此，获得产量高、稳定性好、专一性强、酶活力高的TG酶是市场所需求的。

巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达。

信号肽在蛋白质的分泌中起着重要作用，可引导蛋白分泌至胞外，大大提高蛋白的表达量，在工业化生产外源蛋白的纯化工艺方面具有重要意义。信号肽没有严格专一性，酵母系统对信号肽的利用有一定的灵活性，如何选择适当的信号肽直接影响蛋白质在酵母系统中的分泌水平。

发明内容

本发明通过优化吸水链霉菌的TG酶基因序列，再进一步优化其在毕赤酵母中表达的信号肽序列，以及发酵条件，从而实现了TG酶的高效表达。

本发明的目的是提供优化的TG酶基因。

本发明再一目的是提供TG酶基因的优化的信号肽序列。

本发明的再一目的是提供一种高效表达TG酶的方法。

根据本发明的具体实施方式，对来源于吸水链霉菌的TG酶基因序列(基因登录号：HM231108.1)进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将优化后的tg基因连接至表达载体pPICZαA获得重组载体pPICZαA-tg，接着，经电转化重组载体pPICZαA-tg至毕赤酵母，获得能产TG酶的重组工程菌。

SEQ ID NO.1

根据本发明的具体实施方式，为了进一步提高重组酵母对TG酶的分泌量，优化并筛选、比较了不同信号肽对重组酵母胞外分泌TG酶的影响。分别将表达载体pPICZαA上的α信号肽替换为7种不同来源的信号肽，7种信号肽序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.8所示，获得表达载体pPICZSP1、pPICZSP2、pPICZSP3、pPICZSP4、pPICZSP5、pPICZSP6和pPICZSP7，接着，将优化后的序列连接至上述7中不同的表达载体转化，分别获得重组载体pPICZSP1-tg、pPICZSP2-tg、pPICZSP3-tg、pPICZSP4-tg、pPICZSP5-tg、pPICZSP6-tg和pPICZSP7-tg，将上述构建的重组载体经电转化至毕赤酵母中，获得相应的重组工程菌。

SEQ ID NO.2

SP1：ATGCTTTTGC AAGCTTTCCT TTTCCTTTTG GCTGGTTTTG CAGCCAAAAT ATCTGCA

SEQ ID NO.3