[发明专利]一种D-泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法

说明书

本发明公开了一种D‑泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法。本发明在特制培养基中培养串珠链孢霉菌，将发酵液离心去滤液得到菌丝体，将硅藻土以1‑5％的比例加入冰水中，再放入戊二醛溶液至终浓度为0.5‑2％均匀搅拌；将菌丝体放入上述溶液中搅拌均匀，然后将其在低温放置12‑24h，过滤去离子水洗涤得到固定化的D‑泛酸内酯水解酶细胞。本发明提供的D‑泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法解决了酶在使用前后过滤难的问题，简化了工艺、提高了生产效率；运用该方法使得酶的产量与酶活都有明显的提高、同时增加了酶的使用次数、降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及酶固定化领域，具体涉及一种D-泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法。

背景技术

泛酸称作维生素B5，由泛解酸和b-Ala组成，有旋光性，仅D型有生物活性，泛酸一般的作用是参加体内能量的制造，并可以控制脂肪的新陈代谢，是大脑和神经必需的营养物质。

D-泛酸为维生素类药物，是辅酶A的组成部分，参与体内蛋白质、脂肪、糖的新陈代谢，可用于维生素B缺乏症及周围神经炎，以及手术后的肠绞痛，与维生素C合用可治疗播散性红斑狼疮。D-泛解酸内酯是生产D-泛酸的关键手性中间体，D-泛解酸内酯是由DL-泛解酸内酯拆分而得。

现有技术中，一般对DL-泛解酸内酯的拆分方法有化学法、物理法和生物法：

化学法：用手性拆分剂(手性胺、奎宁化合物、二甲马钱子碱或氯霉胺等)拆分DL-泛解酸内酯，但是化学拆分法存在价格昂贵、成本高、分离困难并有环境污染和毒性问题。

物理法：通过加入诱导结晶拆分DL-泛酸钙，但是该工艺存在收率低、光学纯度不够、成本高、分离难等缺点，而且只能生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物。

生物法：报道较多的是微生物酶法拆分，通过酶拆分DL-泛酸内酯得到D-泛酸内酯。该方法具有成本低、反应条件温和、对环境友好等优点。目前通过水解酶来进行拆分的工艺相对成熟，但现有的发酵法所产生的酶量及酶活不高、酶使用后难以过滤、重复使用次数低等缺点使得生产成本降不下来。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺简单、生产效率高、能够提高酶的产量和活性、增加酶的使用次数的D-泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种D-泛解酸内酯水解酶发酵方法包括步骤：在培养基中培养串珠链孢霉菌，培养条件为：接种量5-10％、培养温度26-30℃、初始pH为7-8、培养时间45-50h；所述培养基成分为：甘油15-20g/L、蛋白胨10-15g/L、玉米浆干粉3-5g/L、豆饼粉15-20g/L、微量元素液3.0ml/L、余量为水。

进一步的，上述D-泛解酸内酯水解酶发酵方法中，所述微量元素液组成如下：

ZnSO₄·7H₂O 0.15-0.2g/L、CaCl₂·4H₂O 0.2-0.25g/L、CuSO₄·5H₂O 0.1-0.2g/L、MnSO₄·H2O 0.1-0.15g/L、FeSO₄·7H₂O 0.0002-0.0003g/L，余量为水。

进一步优选的，上述D-泛解酸内酯水解酶发酵方法中，所述微量元素液组成如下：

ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L、CaCl₂·4H₂O 0.21g/L、CuSO₄·5H₂O 0.15g/L、MnSO₄·H2O0.12g/L、FeSO₄·7H₂O 0.00028g/L，余量为水。