[发明专利]一种全基因组甲基化高通量测序方法

权利要求书

1.一种全基因组甲基化高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下15-零下8摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；

S2：在放置36-48h后，将基因组片段取出，并置于5-8摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置4-7min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；

S3：将S2中形成的基因组测序样本，对样本上的CCGG位点进行确定，然后连接上CCGG位点的接头，随后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为25-35摄氏度；

S4：将S3中扩增后的基因组测序样本使用PTP平板，且PTP平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有ATP硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，A、T、C、G四种碱基依照固定顺序依次循环进行入PTP平板，且每次只进入一个碱基，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸结合形成ATP，在荧光素酶的催化下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；

S5：在S4中反应所释放的光信号被高灵敏度的CCD捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。

2.根据权利要求1所述的一种全基因组甲基化高通量测序方法，其特征在于：在S2中的修饰过程中，必须保证pH值的准确度。

3.根据权利要求1所述的一种全基因组甲基化高通量测序方法，其特征在于：在S3中的扩增具体步骤如下：将基因组测序样本利用微乳液PCR在固定有扩增引物的微球表面上延伸待测模板，扩增时，每个液滴就相当于一个扩增反应器，并包括一个微球、一条模板以及扩增酶，扩增完成时，成功扩增的微球表面存在2*107-5*107个克隆。

4.根据权利要求1所述的一种全基因组甲基化高通量测序方法，其特征在于：在S5中待测模板需完全被聚合为双链。

5.根据权利要求1所述的一种全基因组甲基化高通量测序方法，其特征在于：在S2中对基因组片段进行末端修复前，需要预先对基因组片段进行纯化，以保证基因组片段的干净度。