[发明专利]一种抗鸡CAR1蛋白的多克隆抗体及其制备方法

权利要求书

1.一种抗鸡CAR1蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体由经重组质粒pGEX-4T-2-TvbS1编码表达的重组蛋白GST-TvbS1经生物免疫制得，所述重组质粒pGEX-4T-2-TvbS1的编码基因序列为序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

制备方法包括以下步骤：步骤一：提取鸡tvb基因；

步骤二：构建原核表达载体重组蛋白GST-TvbS1；

步骤三：使用重组蛋白GST-TvbS1对大肠杆菌细胞进行感受态转化，制备工程菌；步骤四：诱导工程菌进行重组蛋白GST-TvbS1的表达，并进行纯化；

步骤五：使用重组蛋白GST-TvbS1或包括重组蛋白GST-TvbS1的组合物对哺乳动物进行免疫，制备多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的多克隆抗体，其特征在于，所述重组蛋白GST-TvbS1由保藏号为GDMCC60225的大肠杆菌菌株BL21制备而成。

3.根据权利要求1所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤一中提取鸡tvb基因的方法如下：

从7～9日龄鸡胚中分离胚胎成纤维细胞，使用Trizol抽提纤维细胞的RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离纯化，得到可用于表达鸡CAR1蛋白的RNA；对所得RNA进行反转录，得到具有鸡tvb基因的cDNA，所述具有鸡tvb基因的cDNA序列为SEQ ID NO.1。

4.根据权利要求1所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤二中构建原核表达载体重组蛋白GST-TvbS1的方法如下：

步骤一：采用RT-PCR方法，使用引物对鸡tvb基因片段进行克隆扩增，并采用电泳的方法对扩增的鸡tvb基因片段进行回收纯化，所述鸡tvb基因片段的序列为SEQ ID NO.2；

步骤二：取步骤一所得鸡tvb基因片段，在25～40℃的条件下用BamHI和xhoI分别对回收的基因片段进行双酶切、电泳、目标片段的回收、纯化；

步骤三：在25～40℃的条件下用BamHI和xhoI分别对空的pGEX-4T-2质粒进行双酶切、电泳、目标片段的回收、纯化；

步骤四：取步骤二所得片段与步骤三所得片段按照重量比7:1混合，加入T4连接酶，并在20～30℃的条件下反应1～2小时，得到连接产物；取全部连接产物转化Ecoli.DH5α感受态，并涂布于含100mg/ml氨苄青霉素的LB或LA平板上，在25～37℃下倒置培养过夜，选取单克隆菌落，置于500μl的含100mg/ml氨苄青霉素的LB或LA液体培养基中培养3小时，提取质粒，得到重组质粒pGEX-4T-2-TvbS1。

5.根据权利要求4所述的多克隆抗体，其特征在于，所述引物为特异性引物，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为CATGGGATCCATGCGCTCAGCTGCGCTC(SEQ ID NO.3)，所述下游引物的核苷酸序列为CATGCTCGAGAGTGGAGGAGCTGGAGGA(SEQ ID NO.4)。

6.根据权利要求1所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤三制备工程菌的方法如下：

取1μl重组质粒pGEX-4T-2-TvbS1对Ecoli.BL21的感受态转化，构建带有重组质粒的工程菌pGEX-4T-2-TvbS1。

7.根据权利要求1所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤四中重组蛋白

GST-TvbS1的表达及纯化方法如下：

将工程菌进行扩大培养，至其OD600值达到0.4～0.6时，加入IPTG于体系中，使体系中的IPTG浓度为0.3～0.6mM，在20～40℃的条件下诱导菌体2小时，收集菌体，过柱纯化得到包涵体，包涵体经变复性，得到重组蛋白GST-TvbS1。