[发明专利]一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用

权利要求书

1.一种诱导毛发再生的干细胞复合体，其由细胞培养支架和干细胞组成，所述细胞培养支架的主体为胶原蛋白凝胶悬滴，干细胞置于胶原蛋白凝胶悬滴内部；可吸收缝合线埋于胶原蛋白凝胶悬滴内部，贯穿于干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面；所述干细胞是以拟胚体形式存在的。

2.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述干细胞至少有两种，其在胶原蛋白凝胶悬滴内部形成表皮分化层和真皮分化层，其中，表皮分化层位于真皮分化层上层，表皮分化层与真皮分化层中的干细胞密度比例为1：2～4。

3.根据权利要求2所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，形成表皮分化层的干细胞为人毛囊干细胞或表皮干细胞。

4.根据权利要求2所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，形成真皮层的干细胞选自间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述拟胚体的用量为：30～48个拟胚体单位接种于胶原蛋白凝胶悬滴中。

6.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述胶原蛋白凝胶悬滴的制备过程为：将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1-1.5：8-10的比例混合均匀，取30-40μL 混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH 0.075-0.085mol/L和HEPES 180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/mL ，pH 3.0-3.5。

7.如权利要求1或2或5所述诱导毛发再生的干细胞复合体的制备方法，包括如下步骤：

1)制作细胞培养支架

将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1：8-10的比例混合均匀，取30-40μL混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH 0.075-0.085mol/L和HEPES 180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/mL ，pH 3.0-3.5；

2)组装干细胞

将干细胞拟胚体置入胶原蛋白凝胶悬滴内，操作完成后再将含干细胞拟胚体的胶原蛋白凝胶悬滴孵育15-20min，完成干细胞的组装；

3)插入可吸收缝合线

将长度5-8mm的可吸收缝合线插入胶原蛋白凝胶悬滴中，贯穿干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面，获得所述诱导毛发再生的干细胞复合体。

8.如权利要求1所述干细胞复合体在制备诱导毛发再生药物中的应用。

9.如 权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述干细胞复合体在培养基中诱导分化培养，每天更换培养基；

其中，所述培养基中含有DMEM/F12培养基，去血清置换液，L-谷氨酸2mM，非必需氨基酸0.1mM、β-巯基乙醇0.1mM、青霉素100U/mL ，链霉素100μg/mL 、bFGF 10-15ng/mL ，其中，DMEM/F12培养基和去血清置换液的体积比为80-90：10-20。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述培养基中含有生长因子。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述诱导分化步骤中，诱导分化培养时间为21天，培养基中添加生长因子的方案如下：

第1天，加入TGF-β2 45-55ng/mL ；

第2天，加入RA 1-1.5ng/mL ；

第3天，更换新鲜培养基后加入RA 1-1.5ng/mL 、TGF-β2 45-55ng/mL 、EGF 15-25ng/mL ，腺苷25-35mg/mL ；

第6天，更换新鲜培养基后加入Wint 10b 450-550ng/mL 、Wint 3a 90-110ng/mL 、腺苷25-35mg/mL 和PFI-3 2-2.5mmol/L；

第10-21天，更换新鲜培养基后加入Wint 10b 500-600ng/ml、Wint 3a 100-120ng/mL和腺苷25-35mg/mL 。