[发明专利]重组牛抵抗素蛋白及其制备方法

说明书

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组牛抵抗素蛋白及其制备方法。针对现有制备牛抵抗素蛋白的方法表达的蛋白所含标签过大，容易造成蛋白构象的改变，不利于活性研究等问题，本发明提供了一种重组牛抵抗素蛋白的制备方法，包括以下步骤：RT‑PCR方法扩增出牛抵抗素基因，构建pET21a‑RETN载体，转化至大肠杆菌，经选择性培养、PCR检测、双酶切鉴定、基因测序，选择带有目的性基因的质粒；再将pET21a‑RETN载体转化至大肠杆菌BL21、Rosetta，诱导表达牛抵抗素蛋白。本发明方法操作简单，成本低廉，表达量高，能够高效制备大量重组牛抵抗素蛋白，为一步对其生理功能的研究和应用于相关疾病的预防和治疗奠定基础。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组牛抵抗素蛋白及其制备方法。

背景技术

抵抗素(Resistin,RETN)是在研究胰岛素增敏剂-噻唑烷二酮衍生物(thaiazolidiones)的作用机制时，于小鼠脂肪组织发现的一种特异性小分子蛋白质。目前研究发现其不仅参与脂糖代谢，调解机体能量水平；甚至还参与炎症反应，是炎症发生过程的重要调控因子，但由于缺少抵抗素原材料，阻碍进一步对其生理功能的研究和应用于相关疾病的预防和治疗。

现有技术中很少有用克隆表达的方法制备牛抵抗素的研究，并且在以往的研究中，没有对克隆条件进行筛选，不利于大量表达，且表达蛋白标签过大，对蛋白原有构象的影响较大，不利于蛋白活性的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有制备牛抵抗素蛋白的方法表达的蛋白所含标签过大，容易造成蛋白构象的改变，不利于活性研究等问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种重组牛抵抗素蛋白及其制备方法。该方法产量大、操作简单，价格低廉，适宜推广使用。

本发明提供一种重组牛抵抗素蛋白的制备方法，包括以下步骤：

a、根据牛抵抗素基因序列设计扩增引物；

b、提取牛的总RNA，RT-PCR得到牛抵抗素基因；

c、构建pET21a-RETN原核表达载体，转化至大肠杆菌DH5a，经选择性培养、PCR检测、双酶切鉴定、基因测序，选择带有牛抵抗素基因的菌液抽提质粒；

d、将步骤c选择的质粒转化至大肠杆菌BL21或Rosetta中，经选择性培养、PCR检测、双酶切鉴定、基因测序，选择带有牛抵抗素目的条带的菌液，转接培养获得菌液，进行SDS-PAGE、免疫印迹试验，再经镍柱过滤，纯化，得到可溶性的重组牛抵抗素蛋白。

其中，上述重组牛抵抗素蛋白的制备方法中，步骤a所述的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：1P1:5’GCTCTAGAATGAAGGCTCTCTCCTTC，5’端带GC保护性碱基和XbaI酶切位点；

SEQ ID NO：2P2:5’CTCGAGCTGGATATGCAGGCG，5’带XhoI酶切位点。

其中，上述重组牛抵抗素蛋白的制备方法中，步骤d所述转接培养时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，适宜的加入浓度为0.2-1.0mmol/L。优选为1.0mmol/L。

其中，上述重组牛抵抗素蛋白的制备方法中，步骤d所述转接培养时诱导温度为20-35℃。优选20℃。

其中，上述重组牛抵抗素蛋白的制备方法中，步骤d所述转接培养时诱导时间为10-16h。优选为14h。

其中，上述重组牛抵抗素蛋白的制备方法中，所述的转化培养基和选择培养基均为LB+1％Ampicillin。

本发明还提供了一种重组牛抵抗素蛋白，由上述方法制备而成。