[发明专利]猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立

说明书

本发明公开了一种同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的PCR方法，分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计两对特异性引物，建立了二重PCR检测方法检测方法，以实现对猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型快速准确检测并鉴定的目的。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法本发明涉及检测猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型的引物。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是目前发现的最小的动物病毒，为环状单链DNA病毒，能在哺乳动物细胞中自主复制。PCV包括PCV1和PCV2两个基因型[2]。PCV1是PK15细胞培养过程中发现的病毒，研究认为对猪无致病性。PCV2基因组由1,767-1,768个核苷酸组成，预测有11个开放阅读框(ORF)。基因间隔区(Intergenic Region，IR)含病毒的复制起点(SL)茎环结构。基因组包含2个主要的ORF，ORF1和ORF2分别编码复制酶(Rep)和衣壳蛋白(Cap)。Cap N端143-145aa(NYS)位置存在一个糖基化位点。Rep包含三个潜在的糖基化位点，分别在第23-25aa(NPS)、第256-258aa(NQT)和第286-288aa(NAT)。临床方面，PCV2主要感染家猪和野猪，大多数在4-11周龄时感染。临床常见的PMWS表现包括仔猪消瘦、呼吸困难和淋巴结明显肿大。PDNS特征为红色到紫色的不规则斑块和皮肤丘疹、皮下出血和水肿、以浅表腹股沟为主的淋巴结肿大、双侧肾脏扩大、小皮质瘀斑和肾盂水肿等。

PCV3是PCV的一种新基因型，2016年首次报道PCV3与心肌炎和肾小球肾炎有关，研究发现在PDNS症状母猪及其流产胎儿体内检出唯一病原体为PCV3。2017年湖北、广东、安徽等省市陆续检测到PCV3感染猪群的现象。PCV3为单股无囊膜DNA，基因组大小2000bp，包含2个主要开放阅读框(ORF)，其中，ORF1和ORF2分别编码由297个氨基酸组成复制酶蛋白Rep，和214个氨基酸组成衣壳蛋白Cap。PCV2与PCV3Cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，同时在研究中发现，二者混合感染率为42.9％。由于PCV3在我国是新发现的疫病，目前尚缺乏针对性的检测技术和方法，无法开展相关病原学和流行病学研究，以科学评估该病对猪群的危害及其程度，并制订出针对性的防控措施。因此，迫切需要发展快速、准确的猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对当前猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型检测技术手段的缺乏，提供一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法及检测用引物。该检测方法的检测灵敏度分别达到可达508copies/μL和412copies/μL，对于单个样本检测时间为1.5个小时，可同时进行大批量的样本检测，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可以实现对猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型快速准确检测并鉴定的目的。

在本发明的一方面，提供一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法，其特征包括：

(1)针对猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型设计能够检测同时检测毒的特异性引物；

(2)将用于检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的引物置于同一反应管中，使用PCR扩增仪进行PCR反应

在本发明提供一种用于同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的引物，其序列为：

PCV3F：TTACTTAGAGAACGGACTTGTAACG

PCV3R：AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG

PCV2F：TTTCAGCGATGACGTATCCAAGGAG

PCV2R：TAGTATTCAAAGGGCACAGTGAGGG