[发明专利]鉴定调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件的方法

说明书

本发明提供鉴定调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件的方法，包括以下步骤：克隆FATP1基因启动子序列；构建系列缺失FATP1基因5′端启动子片段荧光素酶报告载体；将上述荧光素酶报告载体分别转染细胞，进行荧光素酶活性分析，确定FATP1基因核心启动子活性区域；分析该活性区域内转录因子结合位点，对转录因子结合位点进行定点突变，根据突变后FATP1基因启动子活性变化情况，确定调控FATP1基因启动子转录活性调控元件。本发明对调控FATP1基因启动子转录活性调控元件进行鉴定，最终确定了KLF15转录因子结合位点是调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件。

技术领域

本发明涉及鉴定调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件的方法。

背景技术

脂肪酸转运蛋白1(Fatty acid transport protein 1,FATP1)作为促进长链脂肪酸摄入的完整膜蛋白，参与油酸合成调控，是改善牛肉品质的靶基因之一。油酸作为主要单一不饱和脂肪酸中的软脂酸，占牛肉脂质的33％，对血清胆固醇浓度具有抑制作用。胰岛素能够诱导FATP1在细胞核周围以及细胞内异位表达，使长链脂肪酸(LCFA)摄入量增加。FATP1基因在心脏、骨骼肌、脂肪等脂肪酸代谢高的组织中高丰度表达。FATP1基因表达量的增加与前体脂肪细胞分化过程中油酸摄入量的增加表现出相同的趋势，且其多态性与油酸组成比例呈显著相关。FATP1基因表达量与牛肉骨骼肌中肌内脂肪的含量呈显著正相关。尽管FATP1基因表达影响牛骨骼肌中不饱和脂肪酸组成，但目前关于牛FATP1基因的转录调控机制未见报到。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴定调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件的方法，并确定了KLF15转录因子结合位点为调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件。

本发明的第一个目的是提供鉴定调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件的方法，包括以下步骤：

(1)克隆FATP1基因启动子序列；

(2)构建FATP1基因5′端启动子系列缺失片段荧光素酶报告载体；

(3)将步骤(2)的FATP1基因5′端启动子系列缺失片段的荧光素酶报告载体分别进行转染细胞，进行荧光素酶活性分析，确定FATP1基因核心启动子活性区域；

(4)分析FATP1基因核心启动子活性区域内的转录因子结合位点，对转录因子结合位点进行定点突变，根据突变后FATP1基因启动子活性变化情况确定调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件：转录因子结合位点突变后，启动活性显著下降则说明该转录因子结合位点是调控FATP1基因启动子转录活性的调控元件。

作为优选，所述克隆FATP1基因启动子序列，构建FATP1基因启动子系列缺失片段荧光素酶报告载体包括以下步骤：

(1)根据FATP1基因5′UTR序列，以5′-RACE鉴定的转录起始位点为+1位，设计FATP1基因启动子特异性引物，对FATP1基因启动子进行PCR扩增，目的片段为从启动子序列-1856位到+190位；

(2)将PCR扩增产物胶回收，并与 Simple载体连接，转化感受态细胞进行培养，对阳性克隆菌液进行测序，然后对测序结果正确的菌液提取质粒；设计引物并以上述测序正确的菌液为模板，扩增FATP1基因5′端启动子系列缺失片段；

(3)对步骤(2)扩增的FATP1基因5′端启动子系列缺失片段和荧光素酶报告载体分别酶切后连接，将连接产物进行转化，对阳性克隆菌液进行测序，然后对测序结果正确的菌液提取质粒，得到荧光素酶报告载体：pGL-1856/+190(P1)、pGL-1558/+190(P2)、pGL-1261/+190(P3)、pGL-955/+190(P4)、pGL-640/+190(P5)、pGL-387/+190(P6)、pGL-96/+190(P7)。