[发明专利]一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法

说明书

一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法，属于家畜基因工程技术领域。其包括以下步骤：确定FSH效价评定用细胞株；获得FSH剂量依赖表达的候选基因；筛选出与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因。通过本发明的方法能够筛选出与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因，通过该基因为后续制定出能快速、有效、灵敏、精确的检测出FSH效价的方法提供基础。

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种与卵泡刺激素剂量呈线性相关的基因的筛选方法。

背景技术

卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)是由垂体前叶产生的一种糖蛋白类促性腺激素，对促进卵泡的生长发育，调控卵巢各种性激素的合成与分泌发挥着重要作用。FSH的浓度剂量对卵泡发育的启动和周期、卵泡到达成熟的时间以及成熟卵泡数目均至关重要。FSH是生物大分子，不能穿过细胞膜直接传递生物信息，必须通过与靶细胞膜上的FSHR特异性结合发挥其生理功能。研究显示，FSHR阳性表达的卵巢癌细胞株上FSHR的表达量与FSH具有时间和剂量依赖的相关性，当FSH刺激浓度为40IU/L，作用时间为48h时，卵巢癌细胞株的增殖达到峰值(Ivarsson K等,Hum Reprod,2001.16:18-23；Huang Y等,Endocrine-related cancer,2011.18:13-26)，同时相关基因表达量为最佳(Song G等,Journal of Practical Obstetrics and Gynecology,2004.5:025)。此外，卵泡发育过程中，卵泡大小的差异对FSH的依赖程度也会不同，研究发现，猪小卵泡膜颗粒细胞中FSHR结合FSH的能力强于大卵泡(Zheng W等,Gynecologic oncology,2000.76:80-8)。同时，FSHR的mRNA表达量随着卵泡的增大而降低，其在中、小卵泡中表达量显著高于大卵泡(ZhuoyingH,Journal of Chongqing Medical University,2004.2:008)。

在畜牧生产上，FSH具有广泛的应用价值，常用于母畜的同期发情、超数排卵、乏情发情诱导及卵巢疾病的治疗等方面。然而，研究发现，国内FSH及其类似物制品虽价格低廉，但存在着因原材料品质、生产工艺及效价评定等方面的差异造成的效价不稳定问题。

目前用于测定FSH制剂生物效价的方法主要分体内、体外生物活性检测两种方式。其中体内生物活性检测，各国药典(英国、欧洲、美国及中国)都是采用雌幼大鼠卵巢增重法。即利用FSH促进卵泡发育的药理药效特性，基于Steelman和Pohley于1953年建立的生物活性测定方法，所建立的以人绒毛膜促性腺激素(HCG)增敏的雌幼大鼠卵巢增重法。主要体现在动物数、大鼠体重、溶媒中HCG含量和给药剂量的不同上。在动物数上，ChP2010要求每组至少8只，而EP7.1、USP35—NF30要求每组至少5只。动物数量减少，试验误差必定增加，一般生物测定误差在20％左右(Zhanjun L,Drug Standards of China,2012.3(5):336)。在大鼠体重上，ChP2010规定：FSH生物测定，大鼠日龄在19～23d(相差不超过3d)，体重在36～50g；EP7.0规定：大鼠日龄在19～28d(相差不超过3d)；USP35—NF30规定：大鼠日龄在20～21d(相差只有2d)。各国药典对大鼠体重要求相差均在10g以内，雌幼鼠既要满足体内基本无内源性促性腺激素，又要要求其对外源FSH有一定灵敏性。长期试验发现：大鼠体重36～40g，对FSH灵敏度极差。在溶媒中HCG含量上，要求持续的HCG刺激，增敏FSH药效，故均以含有HCG的溶媒配置标准品溶液和供试品溶液，使每天给药时都有不断的HCG刺激。在试验中，HCG剂量偏低容易导致试验灵敏度不高。在给药剂量上，FSH的给药剂量是随着大鼠种属、季节、灵敏度变化而变化。因此，该方法虽能真实反映出FSH的生物学效应，但因其需要大量的试验动物、试验动物的日龄与体重的个体差异及检测耗时长等因素，造成该检测方法成本高、准确性差及操作繁琐等不足。