[发明专利]一种拮抗木霉菌离体快速筛选方法

说明书

本发明公开了一种拮抗木霉离体快速筛选方法；所述筛选方法包括如下步骤：病原菌的转接：将活化后的病原菌打取菌饼在12孔板中培养；木霉菌株的活化：活化培养木霉菌至产孢；对峙培养：沾取木霉孢子，接种于所述12孔板中，置于28℃恒温培养箱中培养4‑6d；拮抗菌株的筛选：使用菌落面积扫描仪扫描所述12孔板中病原菌未被木霉菌寄生的面积；将病原菌面积由大到小排列，病原菌剩余面积越大即该孔对应的木霉菌株拮抗性越差。本发明通过采用多孔板结合菌落面积扫描仪来筛选拮抗木霉，该方法筛选结果与传统平板对峙筛选结果有较高的相关性。

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体是一种拮抗木霉菌离体快速筛选方法。

背景技术

木霉菌是一种能够防治作物灰霉菌、腐霉菌、丝核菌、炭疽菌、镰刀菌等多种植物病害的一种生防菌株，主要通过诱导抗性、协同拮抗、竞争作用，重寄生及抗生作用等生防因子发挥作用，同时能够促进植物生长提高植物抗病性。

然而要获得优良的拮抗木霉菌需要进行多步的筛选。高效筛选木霉菌拮抗菌株时大规模开发木霉菌资源的第一步也是重要的一步。国内外目前关于木霉菌株的离体快速筛选的研究报道较为少见。多是沿用传统的方法，而传统的筛选方法是通过平板对峙培养来初步获得拮抗菌株，这种筛选方法效率较低。不适合大规模木霉菌资源的筛选，制约了优良拮抗木霉菌株的的利用率。

研究一种适合拮抗木霉菌的快速筛选方法具有重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于针对传统拮抗木霉菌筛选效率较低的难题，提供一种拮抗拮抗木霉菌离体快速筛选方法，解决了拮抗木霉菌大规模筛选速度慢的难题。本发明采用多孔板结合菌落面积扫描仪来进行拮抗菌株的大规模快速初筛，该方法节省材料近90％。由筛选准确率可达70％左右。极大的提高了筛选效率。该方法解决了木霉菌大规模初筛的难题，为日后大规模筛选木霉菌资源提供便捷的方法。

本发明的拮抗木霉菌离体快速筛选方法采用如下操作方案：将活化后的病原菌株和木霉菌株，分别以不同的时间及方式接种在12孔板中。培养一定时间后，使用菌落面积扫描仪扫描病原菌未被寄生的面积。筛选得到优良拮抗菌株。

所述的菌落面积扫描仪，是对病原菌未被木霉寄生及占领的面积进行扫描、计算。主要是通过木霉与病原菌相互作用时的竞争作用、重寄生作用及抗生作用相结合，在较小的区域内反应出不同木霉菌拮抗性强弱的趋势。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种拮抗木霉离体快速筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

S1、病原菌的转接：将活化后的病原菌打取菌饼在12孔板中培养24-48h(视病原菌活性而定)；

S2、木霉菌株的活化：活化培养木霉菌至产孢(3d以上)；

S3、对峙培养：沾取木霉孢子，接种于所述12孔板中，置于28℃恒温培养箱中培养4-6d；

S4、拮抗菌株的筛选：使用菌落面积扫描仪扫描所述12孔板中病原菌未被木霉菌寄生的面积；将病原菌剩余面积由大到小排列，病原菌剩余面积越大即该孔对应的木霉菌株拮抗性越差。

优选的，步骤S1中，所述病原菌为真菌。

优选的，所述活化后的病原菌为25℃-28℃培养至菌落大小接近半个孔径，即菌落直径为1.0-1.4cm。

优选的，所述菌饼直径为3-6mm。

优选的，步骤S1中，所述培养采用PDA培养基。

优选的，步骤S2中，所述活化为在28℃恒温培养箱活化至少4d，至菌落表面产孢丰富。

优选的，步骤S3中，所述沾取木霉孢子为使用试管口沾取木霉孢子，所述试管口直径为1.5cm。