[发明专利]一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法

说明书

本发明提供一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR‑RFLP方法，本发明的方法仅需上游引物F和下游引物R（SEQ ID NO.1‑2所示），并仅需常规限制性内切酶Hind III进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程，本发明在禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株快速鉴别诊断检测上快捷准确，解决目前尚未能解决的区别商品化弱毒疫苗毒与野毒株的难题，可以对我国广泛使用疫苗株WF100的养殖场进行禽坦布苏病毒检测与疾病的诊断以及实验研究中这些病毒株的相互鉴别。

技术领域

本发明涉及兽医传染病快速诊断技术领域，特别涉及一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法。

背景技术

禽坦布苏病毒病是一种禽坦布苏病毒（Tembusu virus, TMUV）引起蛋鸭和种鸭产蛋量骤然下降，甚至绝产的烈性传染性疾病之一。患病的高产蛋率（如95%以上）蛋鸭和种鸭，发病后1周内从产蛋率迅速下降至10%以内，严重的于10天停产，这给我国养鸭业带来了灾难性的打击。目前国内对禽坦布苏病的预防主要是唯一一种商品化的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株（WF100株）。存在的问题是：首先蛋鸭在免疫之后的7天左右才产生良好的细胞免疫和体液免疫应答的能力，而一般情况下蛋鸭免疫完就暴露在可能存在禽坦布苏病毒强毒株的环境里，其次免疫接种不能阻止强毒感染和给鸭提供完全保护，疫苗毒与强毒可以在鸭体内长期共存。禽坦布苏病毒疫苗株（WF100株）的使用给禽坦布苏病毒病的确切诊断带来很大的困难，而目前缺乏区分商品化弱毒疫苗毒株与野毒株的鉴别方法，因此建立区分禽坦布苏病毒疫苗株与野毒株的鉴别方法迫在眉睫。

目前在Genbank里录入的我国分离的禽坦布苏病毒野毒株（含鸭源、鸡源、鹅源和鸽源毒的毒株）在NS5基因中均存在核苷酸AAGCTT（Hind III酶切位点），而疫苗毒株（WF100株）在相对应位置的核苷酸为AAGCCT。同时RFLP（Restriction Fragment LengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）是近年来以基因位点差异而引起内切酶位点不同的一种分子生物学标记技术，已广泛应用于真核细胞基因组种群内、种群间（基因差异往往很小）的分型研究工作中，应用RFLP技术可对DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点进行分析。因此，我们设计1组引物并结合禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒商品化弱毒疫苗株的核苷酸特征，利用HindIII酶进行RFLP酶切分析对禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株进行鉴别诊断。本发明检测方法快捷准确，该PCR-RFLP方法可填补国内外相关领域研究空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，设计1组引物并结合禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒商品化弱毒疫苗株的核苷酸特征，利用Hind III酶进行RFLP酶切分析对禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株进行鉴别诊断。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP引物，所述的引物为：

上游引物F：5’- TCAAACCAAGAGGCAAAGTTGT -3’，

下游引物R：5’ -CATATTCTCTGGCCAAATTCTTC -3’。

利用所述引物建立的区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，所述方法包括如下：