[发明专利]一种16联牛乳房炎致病菌核酸分型试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供一种16联牛乳房炎致病菌核酸分型试剂盒及其检测方法。试剂盒的组成如下：A试液：含5×PCR缓冲液、BSA、DMSO、MgCl₂、dNTP、dUTP、MgCl₂、甘油和引物和探针；B试液：UDG酶、ExTaq酶、酶储存液;C试液：去离子水；阳性质控品：为15个致病菌和β‑内酰胺酶扩增序列的重组质粒混合液，用TE buffer将16个检测项目的质粒母液混匀;阴性质控品：TE缓冲液。本发明的奶牛乳腺炎PCR检测方法基于多重TaqMan探针实时荧光PCR技术，可实现并行检测15种病原菌及β‑内酰胺酶抗性基因，全程只需4h，克服关于奶牛致病菌传统检测手段特异性不高、灵敏度低、操作繁琐耗时及现有技术中病原菌检测不全面等问题。

技术领域

本发明属于奶牛乳房炎病原细菌检测技术领域，涉及一种16联牛乳房炎致病菌核酸分型试剂盒及其检测方法。

背景技术

奶牛乳腺炎(mastitis)，是奶牛乳腺受到物理、化学、微生物等因素刺激所引起的奶牛乳腺炎症，主要表现为乳汁发生理化性质及细菌学变化、乳腺组织发生病理学变化，是奶牛养殖业中的四大疾病之一，严重影响奶牛业发展。

根据世界奶牛协会的统计资料，目前全世界约有2.2亿头奶牛，其中约30％患各种类型的乳腺炎。根据患病奶牛乳房有无临床可见变化，美国国家乳房炎委员会NMC将其分为临床乳房炎(Clinical Mastitis)和隐性乳房炎(Subclinical Mastit.is)。我国奶牛临床型乳房炎的发病率约为33.4％，不仅造成产奶量和品质的下降，严重者还会导致乳房废弃，乳区化脓，坏疽、萎缩，致使患牛永远失去泌乳能力而被淘汰，隐性乳房炎奶牛平均阳性率为73.9％，隐性乳房炎因没有临床表现，很难被发现，治疗不及时必然会发展成临床型。因此，快速检测与鉴定奶牛乳汁中的病原菌是及时有效地控制与预防病原菌传播的前提，这对奶牛和人类健康都具有重要意义。

奶牛乳房炎主要是由多种非特定的病原微生物引起，目前已发现的约有150多种，包括细菌、支原体、真菌和病毒。根据其来源和传播方式，可分为传染性和环境性病原微生物。传染性病原微生物可通过人员或设备在牛群间传播扩散，主要包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和支原体等，环境性病原微生物广泛存在于粪尿、污水、垫料、土壤等奶牛生活环境中，可经乳头管进入乳池引起乳腺感染，主要有变形杆菌、酵母菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、牛棒状杆菌、克雷伯氏菌、化脓隐秘杆菌等。

在急性型乳腺炎中，炎症主要由一种致病菌感染引起的。在很多国家，由葡萄球菌属引起的奶牛乳腺炎最为常见。金黄色葡萄球菌是引起乳腺炎的最主要的传染性病原菌，革兰氏染色阳性，绝大多数菌株为凝固酶和触试验阳性，牛群一旦感染往往很难根除，可致人或动物的各种化脓性疾病、乳腺炎、败血症等，也是临床上最难治疗、造成经济损失最大的致病菌。临床上通常通过使用β-内酰胺酶类抗生素对其进行治疗，而抗菌药物的过度使用导致细菌的耐药性不断增强，葡萄球菌属对β-内酰胺酶类抗生素的耐药性源于其所产生的β-内酰胺酶，葡萄球菌属的β-内酰胺酶通过“blaZ”所表达，含有这种基因的病原菌往往会对β-内酰胺酶类抗生素产生耐药性，只能通过使用其它抗生素进行治疗。