[发明专利]一种产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素真菌的同步检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素真菌的同步检测试剂盒，基于多重PCR检测方法，包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对和内标引物对。本发明的检测体系直接靶向毒素合成必需基因，特异性强；同步扩增内参基因，同时设置阳性、阴性及空白对照，有效避免假阴性及假阳性；PCR指数倍增保障了方法灵敏度。

技术领域

本发明属于检测生物技术领域，具体涉及一种产黄曲霉毒素(AF)、赭曲霉毒素(OTA)和展青霉素(PAT)真菌的同步检测试剂盒。

背景技术

AF、OTA及PAT会破坏机体正常机能甚至致癌，是当前国内外最受关注、危害最为严重的生物毒素。青霉属和曲霉属真菌是上述3类毒素的主要产生菌，其中多个种，如黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、赭曲霉(A.ochraceus)、炭黑曲霉(A.carbonarius)、棒曲霉(A.clavatus)、展青霉(Penicillium expansum)和灰黄青霉(P.griseofulvum)等在次生代谢过程中产毒，随谷物、饲料、食品等进入人畜食物链，造成巨大经济损失、严重威胁健康。

对于AF、OTA和PAT本身，国内外已形成成熟的控制及检测规范，而对其源头-产毒真菌本身的检测关注有限，方法开发及应用远远落后于其代谢物。受毒素提取效率、检测方法灵敏度的限制，针对毒素本身的检测方法仅在毒素累积至一定浓度的情况下方可检出，其检测结果仅可作为事后处理提供技术支持，无法实质性挽回经济损失、降低其健康危害；而靶向于产毒病原的检测方法则可在毒素合成早期甚至未合成前评判样品受真菌毒素污染的风险，实现事前干预，最大程度减轻其可能造成的不良后果。因青霉菌和曲霉菌不同种间、菌株间产毒素种类及能力差异大，对产毒株的快速准确鉴定对预测其产毒潜力并有效预防毒素污染可能引发的经济损失及健康危害至关重要。

当前我国对产毒真菌鉴定仍主要依赖形态学分析(如GB 4789.16-2016食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定；SN/T 1035-2011进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法)，操作冗繁、耗时费力、易因近缘种间的形态相似性而导致误判，且方法仅限于对可能产毒的真菌进行分类鉴定至种单元，而未实质性探究其是否产毒，靶向性不强。而特异性靶向毒素生物合成必须基因而建立的PCR鉴定法则可有效克服上述缺陷，同时其指数倍增能力更有力保障了方法的高灵敏度，为有效地提高真菌毒素危害预警能力、保证事前干预、降低危害提供良好的技术支撑。

到目前为止，国内外仅西班牙埃斯特雷马杜拉大学Córdoba带领的团队在2013年报道了一种同步检测食品中上述三类毒素产生菌的多重PCR体系(LUQUE MI，ANDRADE MJ，RODRIGUEZ A，et al.Development of a multiplex PCR method for the detection ofPatulin-，Ochratoxin A-and Aflatoxin-producing moulds in foods[J].FoodAnalytical Methods，2013，6(4)：1113-1121.)，经反复验证发现存在如下缺陷：其体系中未设计内参基因，无法排除因样品DNA质量不佳或PCR体系不合适造成的可能假阴性结果；经比对NCBI中可获得的真菌idh基因序列，序列同源性有限，需设计兼并引物方可有效覆盖不同种属产毒菌；所用omt引物在其他非产毒菌DNA中易产生非特异性扩增片段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素真菌的同步检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素真菌的同步检测试剂盒，基于多重PCR检测方法，包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对和内标引物对，其中，