[发明专利]槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法

说明书

本发明涉及一种槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法，属于胰蛋白酶抑制剂技术领域，提供了一种利用亲和层析方法，从槐角种子中分离出STI的槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法，采用亲和层析方法，从槐角种子中分离出STI，用SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化产物进行分析得出STI的近似分子量分别为12kD，STI具有较高的热稳定性，在80℃时仍有抑制活性，在37℃时活性达到最高，STI在pH6.5～pH8.5条件下具有较高抑制活性，在pH7.8处活性最高，用Lineweaver‑Burk作图法得知，该抑制剂属竞争性抑制类型，Ki值为3.697×1O^‑6mol/L。

技术领域

本发明涉及一种槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法，属于胰蛋白酶抑制剂技术领域。

背景技术

蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物体内，目前已从许多动、植物材料中纯化出多种蛋白酶抑制剂并对其性质进行研究。其中来自大豆、绿豆、赤豆等种子中的胰蛋白酶抑制剂(STI)包含两个组分，其极性氨基酸含量高，属于Bowman-Brik抑制剂类型。研究表明STI可以抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活，故可用于各型胰腺炎的治疗与预防；同时STI能抑制纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的激活因子，阻止纤维蛋白溶酶原的活化，用于治疗和预防各种纤维蛋白溶解所引起的急性出血等；进一步STI能抑制血管舒张素，从而抑制其舒张血管、增加毛细血管通透性、降低血压；此外，在腹腔手术后直接注STI入患者腹腔，能预防肠粘连。

槐角(Sophora japonica L.)为豆科植物槐的干燥花及花蕾、成熟果实。槐角在医疗方面，不仅用于中医配方，而且是中药工业和医药工业的重要原料。据统计，以槐角为原料生产的降压丸、京万红、槐角丸达30多种；对治疗冠心病、高血压、脑血管栓塞等症，疗效显著；现代研究证明，槐角中含有多种多样的化学成分，包括黄酮、异黄酮、生物碱、三萜皂苷、氨基酸和磷脂类成分等，由于其成份结构与己烯雌酚相似，具有雌激素样活性，因此针对骨质疏松、癌症等疑难病症，治疗效果明显。如何从槐角分离出活性良好的胰蛋白酶抑制剂，是本发明所要解决的技术问题。

发明内容

为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种利用亲和层析方法，从槐角种子中分离出STI的槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为槐角胰蛋白酶抑制剂的制备方法，取去皮磨碎的槐角粉25g，加入5倍量的丙酮于9.6℃下抽脂8小时，在通风橱中用布氏漏斗抽成干粉，加入5倍量20mmol/LTris -100mmol/LNaCl pH8.0缓冲液抽提蛋白8小时，然后11000r/min离心20min，取上清，然后再70℃水浴加热10min，再11000r/min离心20min，取上清，用定性滤纸过滤除去杂质，用3kDMWCO(MILLPORE)浓缩至8mL，用亲和层析的方法得到纯化的胰蛋白酶抑制剂。

槐角胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法，包括槐角胰蛋白酶抑制剂,按照以下步骤进行，

a.STI的分子量测定:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,以UnstainedProteinMolecular Weight Marker为对照，分离胶浓度15%,恒流15mA,电泳3h，测定其分子量；

b.热稳定性测定：将粗酶液分别置于50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中各保温10min，离心，取上清，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其稳定性；