[发明专利]一种以ROBO1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用

说明书

本发明公开了一种双特异性抗体，其包含特异性结合肿瘤细胞表面抗原分子的抗原结合结构域(简称R结构域)和特异性结合免疫细胞(例如T细胞、NKT细胞和/或CIK细胞)的抗原结合结构域(简称I结构域)，所述I结构域与R结构域直接连接或通过连接肽连接。本发明提供份以ROBO1为靶点的双特异性抗体双特异性抗体，其能够同时结合T细胞表面的CD3分子和肿瘤细胞表面ROBO1分子，从而拉近肿瘤细胞和T细胞间的距离，能够快速激活静止的T细胞，快速有效的杀伤肿瘤细胞，为抗肿瘤(高表达ROBO1分子)的药物的开发提供了一种新的途径。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种以ROBO1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用。

背景技术

双特异性抗体(bispecific monoclonal antibody，BsAb)能够双重识别肿瘤靶细胞和免疫效应细胞，因此兼有抗体特异性和介导效应细胞的细胞毒作用，经过合适设计的双特异性抗体能够结合和聚集效应细胞于肿瘤部位，激活效应细胞的活性，诱导肿瘤细胞的溶解。自然状态下不存在，只能通过人工方法制备。

双特异性抗体可通过以下途径得到：

①杂交瘤法：杂交瘤细胞是由B细胞和骨髓瘤细胞融合形成的可以产生特异性单克隆抗体的永生化细胞系。两种杂交瘤细胞进一步杂交形成的杂交瘤细胞可以在同一细胞内产生两种不同的轻重链。在同一个细胞内两种轻重链可以随机组装，产生双特异性分子和一系列无功能的单特异性分子。其组装成双特异性分子的概率仅有1/10。因此，要得到单纯的双特异性分子，需要精细的纯化步骤。

②化学交联法：化学交联法是将两种抗体或抗体片段进行交联生产双特异性抗体。最初使用氧化重组方法进行化学交联，现在主要使用异型或同型双功能交联剂。异型双功能交联剂对两种不同的活性集团进行交联。例如氨基和巯基基团。但使用异型双功能交联剂的过程中，会导致一个抗体分子或抗体片段拥有大量的氨基或羧基基团，进而导致教练抗体的不均一性。同型双功能交联剂可以避免这种状况。

以上两种方法中，虽然杂交瘤法生产的双特异性抗体来源可靠，但是由于轻链、重链随机配对组装可产生多种抗体分子形式，使得双特异性抗体的生产和纯化都变得非常困难。而化学交联法交联生产的双特异性抗体成分较均一，但是费时费力且产量很低。基因工程抗体技术的发展为双特异性抗体的研制奠定了基础。

发明内容

CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9kDa、23.1kDa、20.5kDa、18.7kDa，其长度分别由171、207、182、164个氨基酸残基组成。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(Tcell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1所示。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70等)。ITAM的磷酸化、以及与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。