[发明专利]一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法

说明书

本发明涉及猪瘟病毒的构建及应用，旨在提供一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法。该病毒苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为猪瘟病毒弱毒株定点突变株CSFV‑Cmut8，保藏号为CCTCC No：V201744。本发明利用反向遗传学方法，通过对C株基因组上特定的8个位点进行改造，得到CSFV‑Cmut8。相较于母本C株，该病毒可在体外培养细胞中产生较高滴度，在连续传代过程中保持稳定的遗传特性，并对自然宿主猪无致病力。本发明可以提高疫苗的产量，降低成本，作为猪瘟免疫候选疫苗毒株。本发明可用于提高以C株为骨架的其他疫苗的细胞适应性，提高病毒拯救成功率，降低猪瘟细胞苗的生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法。通过该技术的建立，可提高猪瘟弱毒疫苗C株在体外培养细胞中的生长能力，同时也可用于对猪瘟病毒复制、致病机理等方面的深入研究。

背景技术

猪瘟(classical swine fever，CSF)是一种高度接触性传染病，其以发病急、高热稽留、毛细血管壁变性引起的全身泛发性点状出血和脾梗死为特征。虽早已引起各国重视，但由于养猪业的集约化和生猪贸易全球化，猪瘟依然对养猪业构成重大威胁。国际动物卫生组织(OIE)将该病列入A类传染病，并规定为国际重要检疫对象。

猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)。其基因组大小约12300nt，由5’端和3’端非编码区及中间一个大开放阅读框(ORF)组成。其ORF翻译后形成一个由3898个氨基酸构成的多聚蛋白前体，在宿主及病毒特有的蛋白酶水解下，形成4个结构蛋白及8个非结构蛋白。

在许多国家，疫苗免疫依然是控制猪瘟的有效手段。目前广泛应用的疫苗是我国1954年研发出的猪瘟兔化弱毒疫苗C株。半个多世纪以来，由于其遗传稳定、免疫效果好，被国内外公认为安全有效的弱毒疫苗。但由于C株是由石门系强毒在兔体内长期传代获得，其细胞嗜性发生改变，对猪细胞系的适应性差。在用猪细胞系培养时不能产生较高的滴度，限制了C株细胞苗的生产，提高了生产成本。因此，提高C株在体外培养细胞中的适应性，对于降低其生产成本具有重要意义。

近年来，基于猪瘟病毒的反向遗传操作系统已日渐成熟，可在cDNA水平上对C株基因组进行改造。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有猪瘟弱毒疫苗株在细胞中生长慢和毒价低的问题、疫苗生产成本高的问题，提供一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法。本发明能提高疫苗C株在体外培养细胞中的适应性和增殖能力，降低疫苗的生产成本。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一株高繁殖能力猪瘟病毒的弱毒疫苗株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为猪瘟病毒弱毒株定点突变株CSFV-Cmut8，保藏号为CCTCC No：V201744。

本发明进一步提供了前述猪瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)以猪瘟病毒疫苗C株的感染性克隆为模板，通过引入突变位点，利用一步定向克隆方法，将C株基因组上1802位、3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位核苷酸进行突变，得到含有8个特定突变位点的感染性克隆；

所述突变的结果为：C1802A、T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，相对应的氨基酸变化为：S476R、M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；

(2)将突变后的感染性克隆线性化，利用体外转录方法得到突变病毒基因组RNA，并电转至PK-15细胞，通过连续传代的方法得到具有感染性的重组病毒CSFV-Cmut8。