[发明专利]一种用于海洋软体动物体外细胞培养的培养基及其制备方法

说明书

本发明属于动物细胞工程技术领域，具体涉及一种用于海洋软体动物体外细胞培养的培养基及其制备方法，所述培养基包括以下组分：哺乳动物细胞基础培养基；无机盐；胎牛血清；复合抗生素；pH调节剂。本发明培养基可有效地提高海洋软体动物体外细胞培养的成活，可使细胞持续增殖。

技术领域

本发明属于动物细胞工程技术领域，具体涉及一种用于海洋软体动物体外细胞培养的培养基及其制备方法。本发明的培养基可用于海洋软体动物体外原代或继代细胞培养，应用于软体动物如贝类的生理和病理研究，以及病毒的分离、鉴定和增殖，对于贝类疾病的防治具有重要作用。

背景技术

动物细胞原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。分为肿瘤细胞原代培养与非肿瘤细胞原代培养(包括已分化的普通细胞培养和未分化的干细胞培养)。原代培养获取的细胞具有二倍体遗传性，接近和反映体内生长特性，可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，适用于药物敏感性试验、细胞分化、基因功能和调控机制等研究等方面提供指导，因此原代细胞培养作为一种研究手段在生命科学领域获得了广泛的应用。

按照培养对象的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。在动物细胞培养过程中需要根据离体细胞的特点，需要提供适宜的温度、CO₂分压、pH、渗透压和营养条件以使其生长、繁殖。哺乳动物细胞培养的温度控制在37℃，鱼类的温度控制约在26℃。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2～7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。能够提供细胞生长所需的能量物质(N源、C源)、代谢调节控制的物质(无机盐、维生素、激素)，以及所需要的pH和渗透压环境。因此细胞培养液的设计一直是细胞离体培养技术的关键，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。

哺乳动物细胞培养开始于20世纪初，经过长期的发展，市场上目前已有多种不同的培养基，如：RPMI-1640、DMEM、MEM、M199、F-10、F-12K、TC2100和TC1992MK等适合于不同种类哺乳动物细胞培养和昆虫细胞体外培养。

培养基的正确选择是提高细胞原代培养成功率的关键，M199、RPMI 1640与DMEM是细胞培养中常用的培养基，DMEM培养基又分为高糖和低糖等品种，无糖、含有丙酮酸钠和不含丙酮酸钠等多种。现在市场上也有用添加细胞因子不用添加血清的培养基，以及培养干细胞专用的培养基等多种。如高糖培养基适合代谢比较旺盛，分裂速度快的细胞，含有丙酮酸钠的培养基具有促进细胞贴壁的效果，适合于细胞贴壁比较差的细胞。含有PIPES的培养基适合对pH比较敏感的细胞。研究表明，大肠癌细胞原代培养中用RPMI 1640培养基优于DMEM培养基。MCDB/M199培养基与DMEM培养基相比，MCDB/M199有利于维持原代上皮性卵巢肿瘤细胞形态并减缓纤维化，并且MCDB/M199不适于血液系统等细胞生长，利于上皮性卵巢肿瘤细胞培养过程中的纯化。RPMI1640比DMEM更适合人牙周韧带细胞、成纤维样细胞的生长，而DMEM则适合上皮样细胞的生长。因此，培养基的选择应该根据细胞的代谢、种类和文献报道等进行综合考虑，最终应该根据细胞的生长效果进行选择。

海洋软体动物细胞体外培养成功的关键是培养基能够提供细胞生长的最适环境，包括营养、渗透压、pH和调节物质的需要，使海洋软体动物细胞在体外能够生长和繁殖。海洋软体动物生活在海水中，长期的进化使其细胞渗透压与生长环境海水的渗透压相适应。海洋软体动物体外细胞生长的最适温度显著低于哺乳动物细胞，对营养供给的需求也低于哺乳动物细胞。目前市场上的培养基是根据陆生哺乳动物细胞的培养需求研制的，其渗透压低于海洋软体动物细胞生长的最适渗透压，导致海洋软体动物细胞不容易存活和增殖，使体外细胞培养难以为继。