[发明专利]一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法

权利要求书

1.一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1 构建FITC标记的uPA探针：

A.采用FITC Fast Conjugation试剂盒，将FITC偶联到人uPA蛋白上，从而得到FITC标记的uPA配体探针（uPA-FITC）；

B.用标记的uPA-FITC探针与uPAR高表达或缺失细胞系孵育，荧光显微镜检测FITC标记后uPA的生物活性、特异性；

步骤2 构建诱导表达uPAR的酵母表面展示细胞系KM71-uPAR：

A.将人uPAR的cDNA连接到质粒pPICZaA-Flo1p，得到重组质粒pPICZaA-Flo1p-uPAR；

B.将重组质粒通过电击转化导入到毕赤酵母KM71中，筛选阳性克隆菌株；

C.优化重组酵母诱导表达条件，以uPA-FITC为探针检测uPAR在酵母表面的表达，用荧光显微镜监测荧光探针的定位；

步骤3 构建竞争性抑制uPA-uPAR结合的中药混合物筛选体系：

优化酵母细胞数量与uPA-FITC荧光探针的比例，加入阳性阻断剂，用生理盐水洗脱未结合的探针，荧光分光光度计检测，得到不同阻断剂加入量与荧光强度变化曲线；

步骤4 构建从中药混合物中垂钓靶向uPAR的药物先导化合物体系：

A.将能够竞争性阻断uPA-uPAR结合的中药混合物与表面展示uPAR的酵母菌共同孵育，通过离心、洗涤去除未结合物质，解离释放出高亲和力单体成分或成分组；

B.对于具有高亲和力的成分组，重复进行步骤3中竞争性抑制活性进行验证，获得高活性的成分。

2.根据权利要求1所述的基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，其特征在于，步骤3中，酵母细胞数量与uPA-FITC荧光探针的比例为：每100μL菌液加入终浓度为1μM的探针。

3.根据权利要求1所述的基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，其特征在于，步骤4中，A.将能够竞争性阻断uPA-uPAR结合的中药混合物与表面展示uPAR的酵母菌体混合，置于翻转摇床上，37℃孵育30min，1000 r/min，离心5min收集菌体，预冷的PBS洗涤菌体两次，通过离心洗涤去除未结合物质，冰水混合浴超声解离释放出高亲和力单体成分或成分组，4℃，1000 r/min，离心10min收集上清。

4.根据权利要求1所述的基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，其特征在于，步骤4中，B.对高活性的成分进行结构鉴定，对化合物进行确认。