[发明专利]一种神经干细胞冻存液及其使用方法

说明书

本发明公开了一种神经干细胞冻存液及其使用方法。该冻存液包含DMEM/F12基础培养基、二甲基亚砜、血清、白蛋白、添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。该冻存液不仅成本低，而且解决了神经干细胞冻存后复苏活率低的问题，采用本发明公开的神经干细胞冻存液及冻存方法冻存细胞一年后，细胞活率依然高达95％以上，且不影响神经干细胞属性及分化能力。

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体公开了一种神经干细胞冻存液及其使用方法。

背景技术

神经干细胞(Neural stem cell,NSC)作为干细胞的一种,近年来越来越多地受到神经科学领域的重视,实行细胞替代治疗是新发展起来并具有广阔应用前景的治疗战略。神经干细胞的发现及其体外培养的成功,使今后有效地治疗中枢神经系统损伤和神经退行性疾病成为可能。

由中枢神经系统损伤如脑梗死、脑出血、脑外伤、脊髓外伤等和神经变性疾病如帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等所致的功能性丧失,是目前临床治疗领域的难题。传统的手术和药物治疗,只能够终止或预防外伤所致的继发损伤,但不能修复或补偿已经损伤丢失的神经细胞。对于神经变性进展性疾病,药物的疗效不佳,且长期服用易引起其他不良反应。许多向发育中和成年中枢神经系统内植入含有神经干细胞的胚胎脑组织以治疗帕金森氏病、脑外伤和垂体功能低下等的实验,已证明能够部分重建神经环路和功能。

目前神经干细胞的冻存只要有两种形式：第一种为冻存神经球，以直径80～100μm的神经干细胞球为标准进行冻存，冻存液为体积分数70％的DMEMF12、体积分数20％的血清、体积分数10％的DMSO组成。但是神经干细胞间的亲密联系和信号与直径尺寸共同作用，影响着神经干细胞的冻存复苏效果，且很难确定细胞数量，复苏后活率仅能到达80％左右；第二种为冻存单个神经干细胞，冻存液为体积分数70％的DMEMF12、体积分数20％的血清、体积分数10％的DMSO组成。由于冻存液组成相对单一，缺少必要的维持因子等，复苏后细胞活率也只能到达70％左右。

因此，寻找一种有效的保持高活性神经干细胞冻存液和操作方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明人对人NSC成功地进行了冻存、复苏及复苏后再培养,为神经干细胞移植的择期手术和建立“神经干细胞库”提供了方法学基础。还可避免由于神经干细胞传代次数增加而导致的细胞退化、衰老、甚至突变的可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种高活性神经干细胞冻存液及其使用方法，建立一种长期低温保存神经干细胞的方法，以保持细胞的最大存活率，开展有效的干细胞移植及建立干细胞库。

在一个方面，本发明提供了一种神经干细胞冻存液，其包含细胞培养基、二甲基亚砜、血清、白蛋白、添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。

其中，二甲基亚砜(DMSO)的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，避免细胞脱水褶皱；血清能够提高细胞复苏后的活率。在本发明的实施方案中，添加了人血白蛋白作为细胞冻存稳定剂使用，有利于调节细胞复苏时调节渗透压，具有保护细胞的作用，可进一步提高冻存细胞的存储稳定性；在冻存液中添加添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等神经干生长所必须的因子，可以维持冻存微环境，提供必要的营养物质。

在一个具体的实施方案中，按体积百分比计，在神经干细胞冻存液中细胞培养基占50-60％，二甲基亚砜占10-20％，血清占10-20％，白蛋白的溶液占10-40％，添加剂占1-2％；表皮生长因子在神经干细胞冻存液中的浓度为20-30ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子在神经干细胞冻存液中的浓度为20-30ng/ml。

在一个具体的实施方案中，按体积百分比计，在神经干细胞冻存液中白蛋白的溶液占10-20％。