[发明专利]包含C5aR胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体、表达细胞及药物

说明书

本发明提供了一种包含C5aR胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体、表达细胞及药物，所述包含C5aR胞内结构域的嵌合抗原受体，包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，所述的至少一个胞内结构域是指C5aR胞内结构域，或与C5aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域。本发明的嵌合抗原受体可以提高T17细胞亚群，消除调节T细胞的免疫抑制的作用，可以显著提高肿瘤靶细胞的体外杀伤效率，显著改善第二代CAR T细胞对肿瘤的杀伤效果，为CAR‑T细胞治疗领域提供一种新的思路和选择。

技术领域

本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种包含C5aR胞内结构域的嵌合抗原受体，还涉及包含编码C5aR胞内结构域的嵌合抗原受体的核酸和应用。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR,Chimeric Antigen Receptors)T细胞是有望治愈肿瘤的里程碑事件,CAR-T技术是应用基因改造技术，将一段识别肿瘤抗原的单链抗体(single chainfragment variable,scFv)和胞内活化基序重组基因转染至T淋巴细胞上以达到更好的识别及杀伤肿瘤的作用。CAR-T分子通常包括胞外绞链区、跨膜区和胞内信号区。其中胞外绞链区是由单链抗体的重链和轻链可变区通过一条肽段连接而形成；跨膜区则主要来自于如CD8、CD28或4-1BB等分子的跨膜区；胞内信号区则主要来自于CD28、4-1BB、CD3zeta、CD27或OX-40等T细胞传导信号分子的胞内段嵌合体。高亲合力，高特异性的scFv决定CAR-T靶向某种抗原，一旦结合抗原，CAR的胞内段会传输活化以及共刺激信号给T细胞，激活T细胞进而有效靶向杀伤肿瘤细胞。T细胞的激活需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC-I分子结合为活化的第一信号,决定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；T细胞表面的共刺激分子与相应配体结合为活化的第二信号,决定T细胞增殖。简而言之,CAR-T细胞通过抗原-抗体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别,然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。

CAR分子的结构设计经历多代的研究发展。第一代CAR分子的结构包含识别肿瘤细胞表面抗原的scFv、跨膜结构域和激活T细胞的TCR复合物CD3zeta的胞内结构域。由于第一代CAR的信号域是单一信号分子，缺乏共刺激信号，第一代CAR-T细胞在体内存活时间短，对肿瘤细胞的杀伤力弱，疗效并不理想。为充分模拟人体内T淋巴细胞活化的双信号模型，增强第一代CAR分子激活T细胞的能力，开始出第二代CAR，第二代CAR主要是在胞内段结构域加入1个共刺激信号域，目前已经报导的共刺激配体主要集中在特异性结合T细胞上的关联共刺激分子的抗原呈递细胞，包括CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BB、OX-40、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HEVM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、HVEM，进而增强其对肿瘤抗原的识别能力和T淋巴细胞杀伤力(MaQ,GomesEM,LoAS,etal.Advanced generation anti-prostate specific membrane antigen designer Tcells for prostate cancer immunotherapy[J].Prostate,2014,74(3)：286–296)。Savoldo等为6例B细胞淋巴瘤患者构建2种抗CD19-CAR-T细胞，一种CAR的信号域仅有单一信号分子ζ链(第一代CAR-T)，另一种则同时加入了ζ链和共刺激分子CD28(第二代CAR-T)，该研究体外培养及检测结果表明，在体外增殖、细胞因子分泌水平方面，含有CD28信号链的二代CAR-T细胞表现出显著优势。将这2种细胞同时回输入患者体内，定期检测细胞数量，结果表明，二代CAR-T细胞体内增殖速度及存活时间均优于一代CAR-T细胞(SavoldoB，RamosCA，LiuE，eta1.CD28costimulation improves expansion and persistence ofchimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients[J].ClinInvest，2011，121(5)：1822–1826)。同样的研究也证实了含有CD137(4-1BB)信号链的二代CAR-T比一代CAR-T有更强的杀伤效应和持久性(Maude SL,Frey N,Shaw PA,etal.Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in Leukemia.NEngL J M.2014；371:1507-1517)。虽然CAR-T细胞临床试验获得了疗效,但还存在进一步改善的空间，如进一步增强其激活、细胞杀伤功能，从而提高CAR-T疗法的疗效。第三代CAR-T则在第一代基础上整合了2个或2个以上共刺激分子信号，共刺激信号的不同组合可能影响CAR-T细胞的功能和疗效,研究表明,并不是所有的第三代CAR-T都比第二代好。第三代CAR-T已被用于套细胞淋巴瘤(MCL)及滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)临床试验，但其并未显示出比第二代更优的临床结果。目前在急性白血病临床应用上较为成功的主要是第二代CAR-T技术，转染的一个共刺激分子主要是CD28或CD137(4-1BB)，另一个共刺激分子则是CD3zeta。由此可见，现有技术中CAR的结构设计并不是十分成熟，需要进一步针对增强T细胞杀伤功能、增强Th17细胞亚群，消除调节性T细胞的免疫抑制等方面对CAR分子进行改良。