[发明专利]亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法

权利要求书

1.亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是通过微生物发酵作用将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为生物硒。

2.根据权利要求1所述的亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是发酵方法包括如下步骤 ：

（1）菌悬液的制备

挑取一环已活化两到三次的生物菌种置于5 mL液体培养基中，并置于28℃摇床培养24 h后成为菌体培养液，取200 μL菌体培养液加入液体培养基并在28 ℃摇床培养24 h成为菌悬液，再从菌悬液中取2 mL加入到无菌水中，在28 ℃摇床培养，菌液浓度达10⁷ cfu/mL时停止培养；

（2）脱毒转化发酵条件的优化

选择硒添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量六个因素进行Plackett-Burman试验，研究影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素；采用单因素试验和最陡爬坡试验确定各主要因素水平；采用三因素三水平的响应面试验，研究微生物菌种的亚硒酸钠脱毒转化的发酵条件；通过条件优化得到最佳的脱毒转化发酵条件是亚硒酸钠硒添加量81.3 mg/L、初始pH 6.3、培养温度28.6 ℃；

（3）脱毒转化之后的微生物中生物硒分离纯化

将脱毒转化发酵的生物发酵液经过超声破碎后全部装入透析袋内，扎紧上端，于蒸馏水中透析得到亚硒酸钠脱毒转化的生物硒样品液；

（4）硒含量测定

采用氢化物-火焰原子吸收法测定透析袋内生物硒样品液中生物硒含量。

3.如权利要求2所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是所述的微生物菌株是保藏号为CGMCC No.9507的酿酒酵母。

4.如权利要求1或2所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征在于所述生物硒的含量为1.52 mg/kg，半数致死量LD₅₀为935 mg/kg。

5.如权利要求2中所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，包括下述内容：

a. 采用Plackett-Burman法筛选影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素，对亚硒酸钠添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量6个因素进行考察，每个因素分别设高水平和低水平两个水平，高水平是低水平的1.25倍，以亚硒酸钠脱毒转化后生成的生物硒含量作为响应值；

采用Minitab进行各因素主效应分析，得到6个因素中对响应值影响的显著性顺序为：亚硒酸钠添加量>初始pH >培养温度>装液量>接种量>培养时间；把培养时间、装液量、接种量固定在较好水平上；选择亚硒酸钠添加量、初始pH和培养温度这三个因素进一步做单因素试验和正交试验；

b. 采用单因素试验法，以亚硒酸钠添加浓度，初始pH，培养温度为自变量，以生物菌种生物量和生物硒含量为评价指标，确定每个因素的最佳水平；

培养基中其他组分及培养条件保持不变，分别添加不同浓度的亚硒酸钠，测定生物菌种细胞生物量与脱毒转化后生物硒含量，结果表明，生物菌种生物量和生物硒含量均随着硒浓度的增加先增加后降低，且在亚硒酸钠浓度为90 mg/L时达到最高值；

培养基及其他培养条件保持不变，改变初始pH，测定生物菌种生物量与生物硒含量，结果表明生物菌种生物量和生物硒含量均随着初始pH的增加先增加，在初始pH为6.4时达到最高值；

培养基及其他培养条件保持不变，分别在不同温度下培养，测定生物菌种生物量与生物硒含量，结果表明，在培养温度为24 ℃和32 ℃时生物菌种生物量较高，在培养温度为20 ℃和32 ℃时生物硒含量较高；

c. 按陡爬坡法从实验低数值到高数值，根据各因素效应值的大小确定梯度进行试验；以微生物硒含量最高的实验组作为响应面的中心点，用最陡爬坡试验确定响应面的中心点，进一步确定亚硒酸钠脱毒转化的因素水平；

d. 根据最陡爬坡实验和Plackett-Burman实验来确定正交试验的因素与水平，三因素的三个水平分别选取硒添加量是70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L，初始pH分别是6.0、6.4、6.8，培养温度分别是26 ℃、30 ℃、34 ℃。