[发明专利]用于高速分析多指数衰减函数类型实验数据的荧光寿命测量装置及其测量方法

说明书

根据本发明实施例的荧光寿命测量装置包括：照射光发生单元，其用于产生照射光；荧光光子检测单元，其用于收集通过用照射光照射包含荧光分子的至少一个样本而产生的荧光光子；转换单元，其用于放大荧光光子，以将荧光光子转换成荧光信号；以及测量单元，其用于通过使用由模拟函数乘以荧光信号的函数的积分值而获得的函数来分析所述荧光信号的函数的数据。

技术领域

以下描述涉及一种用于测量荧光寿命的荧光寿命测量装置和荧光寿命测量方法，并且更具体地涉及一种可以以最短时间独立地测量两个或更多个混合样本的荧光寿命的荧光寿命测量装置和荧光寿命测量方法。

背景技术

显微镜分为第一代光学显微镜、第二代电子显微镜和第三代扫描探针显微镜，并且广泛应用于诸如医学、分子生物学、新药开发和材料工程等应用。

然而，荧光寿命成像显微镜现在正成为显微镜研究中的关键技术。荧光寿命成像显微镜是最准确地测量荧光共振能量转移(FRET)的设备(FLIM-FRET)。FRET是这样的现象：当两个荧光分子位于10nm或更近的近距离处时，能量从一个荧光分子转移到另一个荧光分子，而没有发射或吸收光。通过使用FRET，可以观察到在几纳米范围内发生并且因此用光学显微镜无法看到的现象，使得在诸如细胞膜、DNA、RNA、蛋白质-蛋白质相互作用等许多生命科学领域中需求迅速增加。

特别地，用作荧光寿命成像显微镜的TCSPC通过使用具有高信号增益的光电检测器(例如PMT或雪崩光电二极管(APD))来检测单光子的响应。不管由单光子产生的响应脉冲的形状在时间轴上是否具有长的宽度，都可以精确地测量单光子的到达时间。以这种方式，也可以测量0.1纳秒的荧光寿命。在每次测量中仅检测到单光子的情况下，可以通过检测所测量的单光子响应的上升沿的到达时间来测量单光子的到达时间。到达时间测量的准确性原则上与光电检测器的输出脉冲宽度无关。然而，高增益光电检测器在操作原理方面具有渡越时间离散(TTS)的问题。与TCSPC中的模拟脉冲响应脉冲宽度相比，PMT在时间测量中表现出高约5倍的精度。以这种方式计数的单光子的到达时间被用于通过数字方法产生时间轴直方图；并且在计数进行了数百次至数千次之后，通过对指数衰减函数进行拟合，将直方图看作荧光光子发射的概率分布函数(PDF)，可以计算荧光寿命。

作为一种具有高灵敏度和稳定性的测量方法，TCSPC广泛用于时间分辨光谱学和荧光寿命成像显微镜(FILM)领域的各种应用。然而，TCSPC在单光子计数方法中基本上限制了测量时间。在TCSPC中，在每个测量周期仅一个光子被计数。即使当通过激发光脉冲从多个荧光分子产生多个荧光光子时，也需要有意地降低由计数器计数的光子的强度，从而每个脉冲仅应产生一个光子。如果计数器在测量周期内检测到两个或多个光子，特别是如果两个光子的到达时间太接近而不能分成两个脉冲，则计数器仅对首先到达的光子的值进行计数，使得发生信号损失，导致比实际值更短的荧光寿命。

此外，即使在单光子中，如果混合具有两种或更多种不同荧光寿命的多个样本，则在独立地测量荧光寿命时可能存在更多的问题。

也就是说，对于具有两个或更多个指数衰减函数的混合的数据，通过计算每个指数衰减函数的衰减常数和特定指数衰减函数在总数据中的比例，可以分析待测量对象的成分。这种计算一般可以通过非线性最小二乘曲线拟合来进行，其中建立指数衰减函数的数学模型，并通过调整数学模型的参数与实验数据进行比较，以获得其间具有最大差异的参数。然而，非线性最小二乘曲线拟合方法使用重复算法，该重复算法通过重复调整参数直到模型函数和测量数据之间的差异变为最小，来将模型函数与测量数据进行比较。如果模型函数和测量数据之间的差异小于给定的容差条件，则非线性最小二乘曲线拟合方法终止计算，因此存在这样的缺点：该方法可能仅获得参数的近似值。此外，该算法是重复计算直到满足容差条件的算法，因此导致用于获得期望值的大量计算。在用于图像构造的MRI或FILM设备的情况下，需要分析构成二维或三维图像的数十万到数百万像素的多个荧光信号，因此存在这样的缺点：完成整个图像的计算时间非常长。

发明内容

技术问题