[发明专利]莱鲍迪苷E生物合成产生甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D4

说明书

在一些方面，本发明涉及通过使用莱鲍迪苷E产生甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D4。在一些方面，本发明涉及突变体CP1酶、突变体HV1酶以及宿主细胞，和利用此类酶例如产生莱鲍迪苷D4的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月6日提交的美国临时申请号62/467,467的优先权，该申请的内容通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本发明的领域涉及可用于通过工程化为所选微生物的生物合成途径来产生特定甜菊醇糖苷的方法和工艺。更特别地，本披露涉及产生先前未知的莱鲍迪苷(rebaudioside)——可以通过酶促转化由莱鲍迪苷E(“Reb E”)合成的莱鲍迪苷D4(“RebD4”)。

背景技术

若干种甜菊醇糖苷是在甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶中发现的化合物，并且已经被广泛用作食品、饲料和饮料中的高强度、低热量甜味剂。这些天然存在的甜菊醇糖苷具有相同的碱二萜结构(甜菊醇骨架))，但在甜菊醇骨架的C13和C19位置上它们的碳水化合物残基修饰(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的数量和结构不同。有趣地是，基础甜菊醇结构的糖‘装饰’中的这些变化显著且不可预料地影响单独的甜菊醇糖苷自身的特性。这些性状包括但不限于味道特征、结晶点、溶解度和感知甜度以及其他差异。具有已知结构的甜菊醇糖苷包括甜菊苷,莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M和杜克苷A。在商业用途方面，莱鲍迪苷M通常被认为是安全的(即，它具有‘GRAS’状态)并且正在研究用于食品和饮料市场的广泛用途。

基于干重，甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、和杜克苷A分别占野生型甜叶菊叶中的甜菊醇糖苷总重量的9.1％、3.8％、0.6％、和0.30％，而其他甜菊醇葡糖苷(例如Reb E)以低得多的量存在，其中Reb D4根本不存在。来自甜叶菊植物的提取物是可商购的，并且在此类提取物中甜菊苷和莱鲍迪苷A是最常见的主要组分。相比之下，其他已知的甜菊醇糖苷典型地作为次要或微量组分存在于甜叶菊提取物中。例如，莱鲍迪苷A在典型的商业制品中的量可以从总的甜菊醇糖苷含量的约20％至多于90％变化，其中莱鲍迪苷B的量是总甜菊醇糖苷的约1％-2％，莱鲍迪苷C的量可以是总甜菊醇糖苷的约7％-15％，并且莱鲍迪苷D的量可以是总甜菊醇糖苷的约2％。在此类提取物中，莱鲍迪苷M仅以极少量存在。有趣的是，莱鲍迪苷E也是甜叶菊植物品种中存在最少的甜菊醇糖苷之一，占存在的总糖苷的不到0.5％。

作为天然甜味剂，并且如上所述，不同甜菊醇糖苷中的每一种具有不同程度的甜度、‘口感’和与这些莱鲍迪苷相关的特定后味。相对于食糖(即“蔗糖”)，甜菊醇糖苷的甜度显著更高。例如，甜菊苷比蔗糖甜100-150倍，但在多种味道测试中指出具有苦的后味；而莱鲍迪苷A和E比蔗糖甜250-450倍，并且后味特征比甜菊苷好得多。然而，这些甜菊醇糖苷自身仍然保持显著的后味。因此，通常已知甜菊提取物的味道特征深受提取物中多种甜菊醇糖苷的相对含量的影响，这反过来可能受到地下植物所经历的环境条件和所用提取方法的影响。植物产量、天气条件和提取条件的这些变化可导致甜味菊提取物中甜菊醇糖苷的组成不一致，使得不同批次的提取产物之间的味道特征变化很大。甜叶菊提取物的味道特征也可以受到提取方法后残留在产物中的植物来源的或环境来源的污染物(如色素、脂类、蛋白类、酚类和糖类)影响。这些污染物典型地具有其自身的异味，使得所得提取物不适合用于在消费品中使用。此外，分离甜叶菊提取物中不丰富的甜菊醇莱鲍迪苷的单独或特定组合的成本是花费和资源过高的。鉴于一些特定甜菊醇糖苷的质量和可用性有限，商业供应可以通过生物转化更好地解决，其中天然酶或特定微生物可以被修饰以携带所需的酶并使用商业上重要的发酵过程来特异性地增加目的糖苷的产生。例如，先前已经报道了通过使用修饰的微生物的发酵途径，甜菊苷到Reb E的生物转化(参见，Yu等人，美国申请号15/016,589，作为美国专利申请公开号US 2016/0207954公布)。可替代地，其他非生物合成手段可用于开发目的甜菊醇糖苷。