[发明专利]在牙齿生物膜中定量离子的方法

说明书

本发明提供了一种对牙齿生物膜的胞外聚合物物质区域中的离子进行定量的方法，该方法是评估口腔护理组合物功效的有效方法。

技术领域

本公开涉及用于定量牙齿生物膜中的一种或多种离子的方法。

背景技术

牙斑是细菌生物膜的一个示例。牙斑通常由细菌和胞外聚合物物质(所谓的“EPS”)构成。EPS是来自微生物的生物聚合物，其中嵌入有生物膜微生物。The EPS Matrix：“House of Biofilm Cells”，Hans-Curt Flemming，Thomas R.Neu和Daniel J.WozniakJ.Bacteriol。2007,189(22):7945。牙斑形成牙垢并且与口腔疾病诸如龋齿和牙周病(例如齿龈炎和牙周炎)相关。牙斑可产生由可发酵糖的细菌降解所产生的酸造成的龋齿。因此，牙斑的控制和去除是重要的，并且是许多口腔护理组合物和方案的目标。因此，通常需要进一步理解牙斑形成的机制并设计控制或去除牙斑的口腔护理组合物。

通常已经描述了用于定量口腔护理组合物(例如，牙膏，漱口水等)在从生物膜测试表面移出细胞或抑制或延迟细胞在测试表面上累积的功效的方法。另外，荧光探针和共聚焦激光扫描显微术(CLSM)通常用于评估生物膜的离子和细菌活力。

离子在生物膜中的作用以及在口腔保健中使用某些离子是正在进行的研究的主题。离子可固有地存在或被引入生物膜中。例如，生物膜天然包含钙离子。牙斑中存在丰富的钙离子(Ca²⁺)，并且牙斑中钙的量比唾液中钙的量大两至三倍。据信，唾液中带正电的钙离子掩盖细菌和牙齿表面之间的负电荷，从而允许细菌附着在牙齿表面上并在牙齿表面上繁殖，从而有助于形成牙斑。因此，抑制钙在生物膜中的作用已成为一些口腔护理组合物中治疗焦点的目标。某些离子已被添加到口腔护理组合物中以帮助预防牙斑和口腔疾病。例如，据报道，氯化十六烷基吡啶鎓(CPC)，亚锡(Sn²⁺)，银(Ag⁺)，铜(Cu²⁺)和锌(Zn²⁺)有助于抑制某些可导致人类邻间牙斑中蛀牙的细菌。氟化物(F-)是发现有助于防止龋齿的离子。

据报道，除了诸如细胞等生物膜的其他组分之外，通常难以纯化EPS基质组分。J.Bacteriol.2007,189(22):7945。然而，需要对定位在牙齿生物膜的EPS区域中的离子进行定量的方法。例如，据信，钙离子充当EPS组分的“胶”或“支架”。诸如亚锡、锌、氟化物之类的其他离子可以从口腔护理组合物释放(或释放可以被优化)到牙齿生物膜的EPS部分以提供增加的功效。在细胞簇内部，局部高细胞密度和EPS的存在阻止了水的流动。在这些生物膜系统中扩散受到限制，因为在牙齿生物膜中流体流动减少并且扩散距离增加。由于导致牙龈问题的大多数致病厌氧微生物通常位于EPS的内层中，因此这些上述离子需要更深地扩散以处理这些微生物。因此，需要研究这些离子在牙齿生物膜的EPS区域中的扩散模式的方法。

发明内容

本发明通过提供定量牙齿生物膜的胞外聚合物物质(“EPS”)区域内的离子的方法来解决这些需求中的至少一者。本发明部分地基于对牙齿生物膜的EPS特异的EPS荧光探针的惊人用途。它是EPS荧光探针与一种或多种离子荧光探针接合的组合，其能够定量牙齿生物膜的EPS区域中的离子。因此，本发明的一个方面提供了定量牙齿生物膜的胞外聚合物物质(“EPS”)区域内的离子的方法，该方法包括以下步骤：用口腔护理组合物任选地处理、优选地处理牙齿生物膜；用EPS荧光探针标记经任选处理的牙齿生物膜；用离子荧光探针标记经任选处理的牙齿生物膜；通过测量从带标记的EPS生物膜发出的荧光来限定牙齿生物膜的EPS区域；以及通过测量从限定的生物膜的EPS区域内的带标记离子发出的荧光来定量离子。优选地，口腔护理组合物选自由以下项组成的组：洁齿剂、牙膏、漱口水、凝胶、免洗型凝胶、以及它们的组合。优选地，来自离子源的离子选自由以下项组成的组：钙、亚锡、锌、银、铜、氯化十六烷基吡啶鎓(CPC)、氟化物、以及它们的组合。测量荧光的一个示例借助共聚焦激光扫描显微术。