[发明专利]热稳定的Cas9核酸酶

权利要求书

1.至少一种靶向RNA分子和Cas蛋白用于结合、裂解、标记或修饰包含靶核酸序列的双链靶多核苷酸的用途，其中：

所述双链靶多核苷酸包含靶核酸链和非靶核酸链，所述靶核酸链包含所述靶核酸序列，所述非靶核酸链包含与所述靶核酸序列互补的前间区核酸序列；

所述Cas蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少77％同一性的序列；

所述至少一种靶向RNA分子识别所述靶序列；

所述非靶核酸链还包含与所述前间区核酸序列的3’末端直接地相邻的前间区相邻基序(PAM)序列，其中所述PAM序列包含5’-NNNNCNN-3’；其中所述用途是在人类细胞中；并且任选地其中所述人类细胞不是胚胎干细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述结合、裂解、标记或修饰发生在20℃和100℃之间的温度、30℃和80℃之间的温度、37℃和78℃之间的温度，优选地55℃以上的温度；更优选地55℃和80℃之间的温度；甚至更优选地55℃和65℃之间的温度或60℃和65℃之间的温度。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中包含所述靶核酸序列的所述多核苷酸被所述Cas蛋白裂解，优选地其中所述裂解是DNA裂解。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中包含所述靶序列的所述靶核酸链是双链DNA，并且所述用途引起包含所述靶核酸序列的所述多核苷酸中的双链断裂。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中包含所述靶核酸序列的所述多核苷酸是双链DNA，所述Cas蛋白缺乏切割所述双链DNA的能力，并且所述用途引起所述多核苷酸的基因沉默。

6.根据权利要求5所述的用途，其中包含所述多核苷酸的所述Cas蛋白包含突变D8A和H582A。

7.根据任一项前述权利要求所述的用途，其中所述PAM序列包含5’-NNNNCNNA-3’[SEQID NO:47]。

8.根据任一项前述权利要求所述的用途，其中所述PAM序列包含5’-NNNNCSAA-3’[SEQID NO:48]。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述PAM序列包含5’-NNNNCCAA-3’[SEQ ID NO:50]。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的用途，其中所述结合、裂解、标记或修饰发生在20℃和70℃之间的温度。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的用途，其中结合、裂解、标记或修饰发生在25℃和65℃之间的温度。

12.根据任一项前述权利要求所述的用途，其中所述Cas蛋白从细菌、古核生物或病毒，优选地从嗜热细菌可获得。

13.根据任一项前述权利要求所述的用途，其中所述Cas蛋白从地芽孢杆菌属的种(Geobacillus sp.)，优选地从热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)可获得。

14.根据任一项前述权利要求所述的用途，其中所述靶向RNA分子包含crRNA和tracrRNA。

15.根据任一项前述权利要求所述的用途，其中所述至少一种靶向RNA分子的长度是在35-200个核苷酸残基的范围中。

16.根据任一项前述权利要求所述的用途，其中所述靶核酸序列的长度是从15个至32个核苷酸残基。

17.根据任一项前述权利要求所述的用途，其中所述Cas蛋白还包含至少一个功能部分。