[发明专利]将血液样品沉积在吸液纸上和随后机械提取血液培养的方法

说明书

本发明涉及将在吸液纸上预先干燥的血液样品中包含的分析物悬浮的方法，其中提供在其上干燥了初始体积大于或等于100μl的血液样品的吸液纸，所述吸液纸具有至少60μL/cm²的样品吸收能力及基重在200g/m²至800g/m²；将所述吸液纸移至一个容器中；将液体提取溶液加入所述容器中，所述提取溶液选自：磷酸盐浓度为10mmol/L至150mmol/L及氯化钠浓度为150mmol/L至350mmol/L的磷酸盐缓冲盐水，或Tris浓度为10mmol/L至150mmol/L及氯化钠浓度为150mmol/L至350mmol/L的Tris缓冲盐水；所述提取溶液的体积与在吸液纸上干燥的血液样品体积相当；将所述吸液纸浸渍在提取溶液中；对所述吸液纸施用机械排水作用；及回收包含在初始血液样品中含有的分析物的提取溶液。

本发明一般涉及医学领域，尤其涉及体外诊断领域。本发明更特别地涉及在DBS技术中使用的在吸液纸上预先干燥的血液样品中所含分析物的提取。

一个多世纪以前，Ivar Bang描述了一种获取在吸液纸上干燥的非侵入性毛细血管血液样品的方法，用于估算葡萄糖含量，代替贮存在试管中的常规静脉血液样品的方法。这种称为“干燥血块(Dried Blood Spot)”或DBS的技术是基于将一滴血沉积在合适的吸液纸上，在贮存和分析之前将其干燥。

1963年，Robert Guthrie等(A simple phenylalanine method for detectingphenylketonuria in large populations of newborn infants.Pediatrics.1963；32:338-343)使用这种技术开发苯丙酮尿症的系统性新生儿筛查。在苏格兰首次实施，在1970年代DBS的使用在英国扩展至婴儿，主要用于检测可以进行治疗的先天代谢缺陷。目前，DBS的使用几乎完全限于新生儿筛查。

在法国，毛细血管血液样品及其在吸液纸上的保存于1978年由法国儿童残疾人协会(法国残疾儿童筛查和预防协会)实施。除了苯丙酮尿症的检测外，从新生儿采集毛细血管血液样品可以检测先天性甲状腺功能减退症、先天性肾上腺增生、囊性纤维化或镰状细胞病。

因此，DBS技术的原理是基于采集血液样品，将采集的血液样品应用于吸液纸，存储以及随后提取在吸液纸上干燥的样品中所含分析物，以对这些分析物进行分析。

目前，毛细血管样品是取自婴儿的手指或脚后跟的毛细血管样品。用如无菌刺血针等工具刺穿皮肤，然后将血滴沉积在吸液纸上印制的圆环中。一旦填充所有印制的圆环，将吸液纸在环境温度下干燥几小时。

一旦干燥，为了贮存，将吸液纸放入密封的塑料袋中，任选地加入一小袋干燥剂和湿度指示剂。干燥剂的目的是完成干燥过程，以减少与血液样品相关的任何感染风险。环境温度下可能的贮存时间根据分析物的性质而不同，对于蛋白质而言为一周至对于核酸为一年或更长。

从吸液纸中提取分析物必须使用标准化程序进行。用特定的打孔器切出一或多个不同直径的吸液纸盘。然后将这些盘置于大体积洗脱缓冲液中，根据提取程序放置不同时间。洗脱缓冲液的性质和体积在重新溶解待测试分析物中起主要作用。文献中已经描述了多种洗脱缓冲液，其中最常见的是盐水缓冲液，通常补充有洗涤剂(tween,triton)、载体蛋白(白蛋白)和螯合剂(EDTA)。例如，有机溶剂(乙腈、甲醇或乙醇)也是用于提取蛋白质的良好洗脱缓冲液。

随后，DBS技术可以作为一些分析的基础。实际上，使用这种技术可以进行如血清诊断、早期儿科分子诊断、循环病毒载量量化以及也可以进行抗性基因分型的分析。

在血清诊断中，可以在缓冲液中洗脱DBS后，通过ELISA或快速测试进行抗体检测。这种程序特别用于流行病学研究。这种类型的分析需要大约50μl的少量样品。

生物诊断需求的增加促进了在医学检测实验室中越来越快速和可靠的自动化装置的出现。自动免疫分析装置可以检测心脏、甲状腺、肿瘤、生殖能力或贫血标记物，或者确定感染性血清学。