[发明专利]POL6聚合酶变体

说明书

本公开内容提供了变体Pol6聚合酶多肽，包含Pol6变体多肽的组合物，以及使用所述变体Pol6多肽来测定核酸测序（例如，通过纳米孔测序）的方法。变体Pol6聚合酶具有降低的模板与聚合酶‑模板复合物的解离速率，这导致相对于衍生它们的亲本Pol6多肽增加的持续合成能力。

技术领域

本文尤其提供了含有基于定向进化实验中鉴定的突变的氨基酸改变的经修饰的DNA聚合酶，所述定向进化实验被设计用于选择更好地适合于重组DNA技术中应用的酶。

背景技术

DNA聚合酶是一种酶家族，其使用单链DNA作为模板以合成互补 DNA链。具体而言，DNA聚合酶可以将游离核苷酸加入新形成链的3'端，导致新链在5'至3'方向的延伸。大多数DNA聚合酶是具有聚合和核酸外切活性的多功能蛋白。例如，许多DNA聚合酶具有3′→5′核酸外切酶活性。这些聚合酶可以识别不正确掺入的核苷酸，并且酶的3′→5′核酸外切酶活性允许切除不正确的核苷酸(该活性被称为校读)。核苷酸切除后，聚合酶可以重新插入正确的核苷酸，并且复制可以继续。许多DNA聚合酶也具有5′→3′核酸外切酶活性。

已经发现聚合酶用于重组DNA应用，包括纳米孔测序。然而，DNA链以1μs至5μs/碱基的速度快速移动通过纳米孔。这使得记录困难并且容易出现背景噪声，而不能获得单核苷酸分辨率。因此，在DNA链或其片段的测序中可以使用在核苷酸上的可检测标签的应用。因此，不仅需要控制测序DNA的速率，而且还需要提供具有改善性能(相对于野生型酶)(诸如掺入经修饰的核苷酸，例如具有或不具有标签的多磷酸核苷酸)的聚合酶。

概述

本发明提供了基于定向进化实验的经修饰的DNA聚合酶(例如，突变体)，所述定向进化实验被设计用于选择在工业或研究应用中使用的条件下赋予有利表型的突变(例如催化经修饰的多磷酸核苷酸(例如标签化核苷酸)在高盐浓度下的掺入)。

除其他方面外，本发明涉及在高盐条件下对于具有或不具有标签的多磷酸核苷酸具有改进的延伸速率和解离速率的经修饰的DNA聚合酶。

本发明的一个方面提供了通过对野生型（WT）Pol6（SEQ ID NO：1；没有His标签的野生型pol6）进行几代诱变针对其对于多磷酸核苷酸的延伸速率和核苷酸解离速率所选的先进聚合酶突变。

发明人在此发现，发现几种突变体具有改进的延伸速率，如使用带有或不带标签的多磷酸核苷酸的基于荧光共振能量转移（FRET）的置换测定所示的。参见图1。

在一些实施方案中，经修饰的聚合酶具有大于亲本聚合酶的k_cat。在一些实施方案中，经修饰的聚合酶具有小于亲本聚合酶的k_off。在一些实施方案中，经修饰的聚合酶具有是亲本聚合酶的至少1.5、2.0或2.5倍的k_cat/k_off(即比率)。