[发明专利]NGS文库浓度的标准化

说明书

下一代测序(NGS)工作流程中的瓶颈是文库的定量，用于准确汇集和装载测序仪器流动池或芯片。本文公开了相较于现有方法改善性能并减少时间的方法。

相关申请交叉引用

本申请要求2016年9月6日提交的美国临时专利申请号62/384,118的优先权，其通过引用全文纳入本文。

背景技术

为了使高质量下一代测序(NGS)数据最大化，至关重要的是给测序仪器加载数量准确的文库DNA。文库DNA装载数量不足会导致簇密度低(Illumina)/模板阳性ISP低(IonTorrent)并且降低测序输出，而文库DNA过剩会导致嵌合簇(Illumina)/多克隆ISP(IonTorrent)并导致低量低质量数据。当汇集文库用于并行测序时，不准确的定量会导致测序数据不平衡，其中非足量文库被过度测序，而过量文库则测序不足。出于这些原因，可测序文库分子数量的准确定量在NGS工作流程是至关重要的一步。当汇集文库以产生用于杂交捕获的并行集合时，同样需要准确的文库定量。当前用于文库定量的方法包括芯片电泳(例如，安捷伦生物分析仪(Agilent Bioanalyzer)，dsDNA的荧光测定方法(例如，Qubit)和qPCR(各种市售可得的试剂盒)。芯片电泳和荧光测定方法两者都仅能准确定量PCR扩增的、对全部加了衔接子的文库分子进行了富集的文库，因为这些方法不能区分无PCR文库制备物中的功能性分子(包含两个NGS衔接子的片段)和非功能性分子(仅包含1种或没有NGS衔接子的片段)。qPCR在NGS工作流程中被广泛地使用，因为其能够准确定量功能性文库分子，但是该方案涉及多次移液步骤并且花费大量的时间。各文库必需经连续稀释，qPCR试验按照标准曲线一式三份运行，然后进行qPCR数据分析。qPCR定量过程接近2个小时，包括至少45分钟操作时间。最终，当汇集样品时，所有这些方法都需要针对各NGS文库手动浓度调整。此外，当前所有文库定量都依赖于文库插入大小(insert size)将质量转化成摩尔浓度，并且，如果文库的尺寸分布宽或尺寸不确定，那就无法准确确定摩尔定量。

发明内容

本公开提供了不依赖于文库插入大小的用于NGS文库摩尔标准化的新方法。相对于文库定量然后手动调整文库浓度(图1A)，该方法提供了简便的替代方法。本文所述文库标准化在单个步骤中或多个步骤中发生，以产生处理等摩尔NGS文库量的数个样品。

需要单个步骤的方法是基于PCR的标准化(N-PCR)，其中使用限定浓度的标准化引物(N-PCR引物)以加快的退火动力学和达成PCR反应期间引物全利用的扩增条件进行各NGS文库的扩增，由此提供指定摩尔量的各NGS文库。

需要多个步骤的方法是酶法标准化，这需要：

a.用预标准化(pre-Normalization)引物(pre-N引物)PCR扩增得过量的各NGS文库，所述预标准化引物在PCR中或PCR后的酶促消化过程中在一端或两端产生5'或3'突出端，然后进行纯化步骤；

b.各扩增所得文库与指定摩尔量的标准化探针(N-探针(N-probe))－有些实施方式中还有DNA连接酶－孵育，其中探针退火并连接到5'或3'突出端从而选出与N-探针等摩尔的文库部分；和

c.对于一些实施方式，通过酶促消化未获选文库部分或通过从固相固定化中酶介导释放探针选定部分进行探针选定部分的分离。

酶法标准化方法的示例性工作流程如图1B所示。可以看出的是，相比如图1A所示的qPCR定量和手动调整，该过程可以减少人工操作和总时间。