[发明专利]单一向导RNA、CRISPR/CAS9系统及其使用方法

权利要求书

1.一种针对用于预防、改善或治疗角膜营养不良的CRISPR/Cas9系统设计的单一向导RNA(sgRNA)。

2.根据权利要求1所述的sgRNA，包含(i)具有选自SEQ ID NO:(10+4n)或SEQ ID NO:(11+4n)的核苷酸序列的CRISPR靶向RNA(crRNA)序列，其中n为0至221的整数，和(ii)反式激活crRNA(tracrRNA)序列，其中所述crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的。

3.根据权利要求2所述的sgRNA，其中所述tracrRNA包含与SEQ ID NO:2或6的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。

4.一种设计用于CRISPR/Cas9系统的sgRNA对，所述sgRNA对包含：

(i)第一sgRNA，其包含(a)用于顺式位于引起疾病的突变或SNP的3'-端侧的产生第一原型间隔区相邻基序(PAM)的突变或单核苷酸多态性(SNP)的第一crRNA序列，(b)tracrRNA序列，其中所述第一crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的；

(ii)第二sgRNA，其包含(a)用于顺式在引起疾病的突变或SNP的5'-端侧的产生第二PAM的突变或SNP的第二crRNA向导序列；(b)tracrRNA序列，其中所述第二crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的。

5.根据权利要求4所述的sgRNA对，其中所述CRISPR/Cas9系统用于预防、改善或治疗角膜营养不良。

6.根据权利要求4或5所述的sgRNA对，其中所述产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因中。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的sgRNA对，其中所述产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因的内含子中。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的sgRNA对，其中所述第一crRNA序列和所述第二crRNA序列中的至少一种包含选自图19至图35所列序列的核苷酸序列；和/或所述第一crRNA序列和所述第二crRNA序列中的至少一种包含选自表2所列序列的核苷酸序列。

9.一种工程化的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，其包含(i)至少一种载体，其包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和根据权利要求1至3任一项所述的sgRNA，或者(ii)至少一种载体，其包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和根据权利要求4至8中任一项所述的sgRNA对，其中所述载体中的Cas9核酸酶和所述sgRNA对不是天然一起出现的。

10.根据权利要求9所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述Cas9核酸酶来自链球菌、葡萄球菌或其变体。

11.根据权利要求9至10中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述Cas9核酸酶包含与选自SEQ ID NO:4或8的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述编码Cas9核酸酶的核苷酸分子包含与选自SEQ ID NO:3或7的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其还包含修复核苷酸分子。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其还包含一种或更多种核定位信号(NLS)。